2012鱼类细胞工程基础.pptVIP

鱼类细胞工程基础实验 课程安排 动物细胞工程 动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进行在细胞水平上的遗传操作,从而获得新型生物。 动物细胞工程常用技术 动物细胞培养技术 动物细胞融合技术 单克隆抗体技术 胚胎移植技术 细胞核移植技术 动物细胞培养 细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进行培养，使之继续生存、生长、增殖。 原代培养 传代培养 永久细胞系 细胞培养在水产业的应用 鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备 鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等 水产基础理论 鱼类免疫学 鱼类遗传学 本实验课的目的 培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。 掌握无菌操作，养成规范的实验室工作习惯。 为将来适应多种领域的工作打基础。 鱼类细胞培养的基本条件 温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带鱼)、15℃(寒带鱼)、37 ℃(水生哺乳动物)。 鱼类细胞培养的基本条件 2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH至7.4左右。 鱼类细胞培养的基本条件 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需用平衡盐溶液配制各种试剂。 常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution） D--Hanks 鱼类细胞培养的基本条件 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。 鱼类细胞培养的基本条件 支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。 去离子水/三次蒸馏水 鱼类细胞培养的基本条件 无菌条件 体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。 实验室仪器设备 实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 干燥箱: 用于干燥 超净工作台: 用于无菌操作 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 液氮罐：用于细胞长期保存 考核方法 实验报告（论文格式） 一. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题\经验\体会） 要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。 修读要求 1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。 实验一二 思考题 培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌 ？ 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？ 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？ 实验五 染色体制备 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。 操作步骤 一、准备细胞 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 培养24 h 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素（1μg/L） 培养13-15h 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞 加2 mL PBS混匀细胞 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内 慢慢加10mL双蒸水（4℃） 室温孵育10min 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：甲醇＝1：3） 室温放置10min 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 弃去上清，留约 2mL 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 1000rpm离心，5min 弃去上清，留约 0.5mL 加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀 孵育 5分钟 1000 rpm离心，5分钟 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细