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纯化水微生物限度检查法验证方案 1. 验证目的： 纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。确认该方法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。 2.职责 2.1验证委员会：负责验证方案及报告的批准并组织协调验证工作并签发验证证书。 2.2.验证组长 2.2.1.负责验证方案的起草 2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案的顺利实施。 2.2.3.负责验证报告的审批。 2.2.4.负责发放验证证书。 2.2.5.负责再验证周期的确认。 2．3. 质保部 2．3.1.负责验证方案审核 2．3.2.负责取样及对样品的检验 2．3.3.负责收集验证记录，并加以分析后，起草验证报告。 2．3.4.负责验证数据及结果的审核 3. 参照标准： 2005版中国药典二部附录XI J微生物限度检查法。 4. 验证项目： 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 5. 合格标准： 试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。 6. 试验材料： 6.1. 被验证产品： 品名 纯化水 取样点 总出水口 洗瓶用水 洗涤消毒 检验量 5ml 6.2. 仪器设备： 6.2.1. SYQ/ZDX-35B1型自动座式压力蒸汽灭菌器 6.2.2. YOKO-ZX紫外分析暗箱 6.2.3. SW-EJ-2FB双人净化工作台 6.2.4. 101-2A电热鼓风干燥箱 6.2.5.SPX-250B型生化培养箱 (23～28℃) 6.2.6.PHW-200S恒温培养箱(35～37℃) 6.2.7.CR-50×50×65数显隔水式恒温培养箱(30～35℃) 6.3. 稀释剂： 0.9%无菌氯化钠溶液 6.4. 验证用培养基 名称 生产厂家 批号 营养琼脂培养基 营养肉汤培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 改良马丁培养基 改良马丁琼脂培养基 6.5. 验证用菌株：(第3代) 验证菌株 培养基 培养温度 培养时间（小时） 大肠埃希菌 营养肉汤 30—35℃ 金黄色葡萄球菌 营养肉汤 30—35℃ 枯草芽孢杆菌 营养肉汤 30—35℃ 白色念珠菌 改良马丁培养基 23—28℃ 黑曲霉菌 改良马丁琼脂培养基 23—28℃ 7. 菌液制备 7.1. 取经35～℃培养18~24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6~10-7约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。 7.2.取经24～℃培养24~48小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。 7.3.取经24～℃培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液10ml将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液，取此孢子悬液0.1ml加到9.9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。 8.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿） 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别划线接种至营养琼脂培养基，置35～℃培养二天；白色念珠菌、黑曲霉分别划线接种至玫瑰红钠琼脂培养基，置24～℃培养三天。 菌落计数结果（2个平皿计数取平均值）见下表 菌落计数结果（cfu∕ml） 试验次数 10-5稀释 10-6稀释 10-7稀释 1 2 3 1 2 3 1 2 3 大肠埃希菌 87.5 85 70.5 金黄色葡萄球菌 107.5 91.5 69.5 枯草芽孢杆菌 92.5 79.5 74.5 白色念珠菌 76 79 84.5 黑曲霉 51 80 81 9.验证方法： 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 9.1.验证日期 2010年7月6日至2010年7月 10日 9. 2.供试品名称及取样点： 纯化水 取样点 总出水口 洗瓶用水 洗涤消毒 9.3. 供试品制备 方法建立: 2005版中国药典规定纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。但没规定取样量,由于所使用的滤膜孔径不大于0.45um ，直径为50mm, 规定每片滤膜上的菌落数应不超过100个。如果取样量过大,样品含菌量较多,就会造成细菌不宜分散, 点计困难; 如果取样量过少,不能有效反映样品染菌量。为此参照注