2011年下期遗传学实验指导(阅读).docVIP

实验一 人类染色体核型组型分析 一、实验目的： 1、通过本实验：初步了解外周淋巴血细胞培养的方法和正常人体chro的组型分析。 2、掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法。 3、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。 二、实验原理： 人体外周血的组成： 红细胞 嗜中性白血球 外周血 血小板 粒细胞 嗜酸性白血球 白细胞 单核细胞 嗜碱性白血球 淋巴cell 在体外培养过程中，只有淋巴细胞存活，其它类型的细胞死亡。外周血淋巴细胞几乎处于细胞周期的G期（分裂期）。但在体外给予一定的条件培养，经53－72小时就可获得大量的有丝分裂细胞。运用这种方法可用来对人体的chro进行检查，鉴别某些遗传性疾病。 血淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。主要原因是材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的效应（如病毒、电离幅射、化学试剂）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。 淋巴细胞的培养有许多方法，常用的是全血培养和分离白细胞培养。全血培养又称为微量血培养，因为通常只要有0.2～0.5mL的血液就可以进行实验。见下图 正常情况下哺乳动物的外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。低等动物如两栖类的外周血中也只是偶然能见到分裂相。人的外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G0期，一般情况下是不再分裂的。在培养液中加入植物凝血素（PHA）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。 其它动物在制备染色体时也可以采用这种方法，但应根据对象进行适当的改动。即使是人体的外周血，在培养时也会由于个体的差异、培养的条件及操作者本人的经验而有相当的差异。染色体形态及各部位名称见下图。 正常情况下，人类每个体细胞有22对常染色体和一对性染色体，共46条染色体，通常表示为男46，XY；女46，XX。根据各组染色体的特征予以分组：A组 （NO1~3）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或近乎在中部； B组 （NO4~5）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂； C组（NO6~12＋X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于其间，一般难以区分； D组 （NO13~15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末端，随体与短臂之间的区域很少着色； E组 （NO16~18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体； F组 （NO19~20）为两对小的着丝粒； G组 （NO21~22＋Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在NO21~22的短臂上可见随体，Y通常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。人类染色体标准图谱见下图： 三、实验材料及器材： 人外周血、小牛血清、针筒、离心机、冰箱、双目显微镜等 四、实验步骤： 1、培养液的分装：在无菌室内或接种罩内，也移液管将已通过0.22μ细菌过滤器的培养液和其它各试剂分装入10mL培养瓶中，每瓶1640培养液4mL，小牛血清1mL，PHA0.2mL，肝素0.05mL，双抗（青霉素和链霉素，终浓度为100U/mL），用3.5％碳酸氢钠调节pH为7.2～7.4，加好瓶塞，－20℃保存备用。 2、采血培养（男、女）针筒先用肝素液浸润针筒（防止血液凝固） 去掉肝素 抽V血约5ml（用8号针头每瓶加10滴） 稍摇动37℃培养72小时 无菌操作加入秋水仙素0.1～0.15ml/瓶 37℃培养3小时 倒入离心管中2000转/分钟，离心5分钟 去除上清液，加0.075M KCl 5ml 打匀 37℃处理20分钟 加入固定液摇匀 离心2000转/分钟，7分钟 去除上清液，加入固定液打散，固定15分钟 离心 去除上清液，加入固定液15分钟 去除上清液 加入1ml固定液，制成细胞悬液 从冰箱中取出玻片，立即滴上悬液，每片3～4滴 酒精灯上烤干 Geimsa染色30分钟 倒去染液 用小水冲洗 待干后镜检 显微摄影 核型分析。 2、染色体配对鉴定方法。 组别 染色体号 长度 着丝点 大致位置 核 型