免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用.ppt

免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用 南通医学院 陈莉 不同克隆所要检测的是相似抗原，相同抗原可作为浓缩形式或未稀释形式，还可作为培养基上清液，或即用型液体出售，同一商品可在不同分销商名下作为不同名称的商品出售，购买者所购买的试剂不必去证实制造商及分销商所声称的灵敏度和特异性，而且有趣的是所有商业抗体都标明“非诊断用”，但事实上这些抗体正是用于诊断这一目的。 关于免疫组化染色的标准问题最初是由美国生物染色委员会(Biological staiN commissioN USA)的一项小研究而引发的，该组织评估了5家独立实验室针对3种多发性肿瘤块进行的单纯抗-角蛋白抗体染色，所报道的染色形式在所参加的5家实验室中有显著差别[34]，另一项关于乳腺癌中激素受体免疫染色在多家实验室的研究中也得到了不尽相同的结果。 毫无疑问，免疫组化如能正确应用，确实是一种有力而又有用的诊断工具，它为外科病理学家提供了高水准的专业服务，补充了他们的观察技巧，拓宽了形态学诊断的潜能。为了保证免疫染色的高质量， 我们对切片处理方面的所有问题都应认真考虑与检查，以确保组织抗原的最佳保存。免疫组化在未完成之前无可靠的检测手段，染色结果常反复无常，这与许多因素有关，如抗原保存，蛋白酶消化，增强技术及对抗体的管理、使用和试剂的浓度，因此稳定质量的保持比其它的实验室技术更困难，除非进行大量的免疫组化操作，否则保持好的质量与取得合理的经验是很难的。 每次使用新抗体时都必须检测其最佳稀释度、使用免疫组化方法与组织固定等。但使用一些试剂盒或即用型试剂，可以减少上述麻烦，使用方便。但试剂盒也有其自身的缺陷，这些即用型已稀释过的抗体给人有一种方便与稳定的假象，某些试剂盒无法达到期望效果，但又难以将这些试剂定为假货。药盒即用型试剂由制造商设计成适合所有使用者，其试剂浓度并不是最佳浓度，因为各个实验室有不同的固定与组织处理方法，所以使用即用型试剂的结果常并不是最佳结果。 免疫染色质量控制需要设置对照组，包括已知存在抗原的阳性对照组，如含抗原的正常组织，最好是使用含少量抗原的瘤组织作为对照，使与所检测切片中的抗原水平趋于一致，而且后者可能含有表达抗原的非瘤组织，可以作为内部对照。阴性对照，应用缺乏抗原的组织切片。空白对照，即采用非免疫血清，缓冲液，或其它无特异性的抗体（最好是同一免疫球蛋白的类型）以取代初级抗原的位置或用抗原预先吸附抗体而除去阳性染色，这常是可靠的对照，但由于该法不实用而未被常规使用。 实验室在确定使用新抗体之前，使用者应该了解下列情况： １、确定对于所要研究抗原的最敏感抗体； ２、检测抗体的最佳工作浓度； ３、熟悉相关试剂的灵敏度、特异性、特别应了解哪些组织表达这些抗原，确定免疫染色的方法及细胞中的抗原分布，这将有助于确定阳性染色，特别是当细胞表达水平低时尤为重要 。 ４、使用于诊断样品之前，应用阳性切片进行预试验以获得使用抗体的经验； ５、在实验室中应有一份该试剂已出版的文献作为参考资料，对于非特异性染色的假阳性等情况，要心中有数，以避免不确切的解释、推论等。 优秀免疫组化切片的观察 十二、免疫组化染色的说明与缺陷 １、免疫组化染色的形式，病理学家在免疫组化染色中不应只限于熟悉阳性反应的特征，还应注意染色中的各种变化，因为不同的组织、固定处理方法、及抗体特性，免疫组化染色结果有变化。不正确的结果常来源于技术性错误或阐述的错误。真正阳性染色应是将所研究的特异细胞染成棕色，特别是单个细胞在一群细胞中或一个肿瘤中的异源性染色。在DAB显色中，阳性反应棕色颗粒可以显示单个细胞胞浆、细胞膜、核周区域、细胞核或仅限于胞浆的一个区域，如细胞的一极等。弥漫棕色或单一黄色的肿瘤细胞染色可能是非特异性的。 多数用于肿瘤诊断的免疫标记物定位于胞浆或细胞膜表面，如CEA、HBSAg等，表达于细胞核的有P53、ki-67、LamiN、CycliN D1,雌激素，孕酮及雄激素蛋白。定位于细胞核及膜上表达的抗原有NE、LN2(CD74)、S-100蛋白等，核膜上表达的有C-erbB-2,表面免疫球蛋白等。抗原的特异性分布形式有CD30在R-S细胞显示膜标记，核周高尔基氏体染色，偶尔胞浆反应，Merkel细胞癌显示角蛋白细丝和N细丝核旁螺旋状。恶性间皮瘤的鉴别是通过瘤细胞周围长而复杂的微绒毛，由单抗上皮膜抗原清楚的标记。 所谓横纹肌样肿瘤及其刺激物表现出显著的VimeNtiN细丝呈球状团块，这与该部位超微结构上基质间细丝形成的螺旋相一致。免疫组化染色中更强调了HE切片上所见不到的细胞形态