蛋白质测定.pptVIP

教学目标 教学内容（重点及难点） 1、凯氏定氮法（蛋白质系数，氮与蛋白质之间的关系，各种试剂的用途，各种步骤的目的及注意事项） 2、氨基态氮的测定（甲醛固定氨基的作用；不同PH值指示的滴定意义） 测定原理 食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H、O，不含有氮，含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志，是存在于蛋白质中最为特征的元素。 有一前提： 这些氮元素都是指的是蛋白质里的氮元素，因此，当这些氮元素来源于氮元素含量极高的三聚氰胺时，是无法用蛋白质系数返算为产品中蛋白含量的。 凯氏定氮法包括有：常量法、微量法、经改进后的改良凯氏定氮法这三种方法的不同之处在于：仪器、装置、试剂等都有了改进 凯氏定氮法测定的是粗蛋白的含量 因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等作蛋白质的含氮化合物，故凯氏定氮法通常将测定结果称为粗蛋白质含量。 Ｂ　碱化蒸馏：然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 Ｃ　吸收与滴定： 　 用H3BO3吸收后生成硼酸氨； 再以标准HCl溶液滴定； 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 1加硫酸作用： 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 　　　加入量不能太大：否则消化体系温度过高，生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 　　　也可以加入硫酸钠、氯化钾提高沸点，效果较差 2.1.2.3 碱化、蒸馏 消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使溶液呈碱性，加热蒸馏，释放出氨气 2.1.2.4　吸收与滴定 4%硼酸吸收； 盐酸标准溶液滴定； 指示剂为混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）。 甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂终点判断： 本实验的定量以氮原子的去向为准 一开始是蛋白-----氨气-----硼酸胺 所以必须关注这三种物质不能在检测过程中的损失，无论在消化还是吸收或是滴定过程中，都要保证其不损失 2.1.4 计算 2.1.5消化过程操作注意事项： 消化时不用强火，保持和缓沸腾，以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。 消化过程中应不时转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化完全。 问题二：加硫酸铜作用 　起催化剂的作用。 还可指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。 指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 问题三：消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么，如何解决？ 样品中若含脂肪或糖较多 开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 蒸馏完毕 先将冷凝管下端提离液面清洗管口 再蒸1分钟，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查．如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 （避免吸收液倒吸） 不能超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，可置于冷水浴中使用。 问题八：混合指示剂颜色： 在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 问题九：硫酸与盐酸滴定的区别 注意：H2SO4 与 HCL的区别 1/2（H2SO4）= HCL 凯氏定氮瓶的结构 对于定氮操作：内层加消化液、加碱液是反应发生器。 外层加无氨蒸馏水、加热产生蒸汽---蒸汽从内外两层连接小口处通入，对反应液进行水蒸气蒸馏。还有一部分是氨气冷凝装置。 对于定氮瓶清洗操作：倒吸---需有压力差（内层压力应大，外层压力应小才能产生倒吸）---由于本实验装置中无产生压力装置，是利用了大气压力，和冷却水快速流过细玻璃管所产生的负压之间的压差---找寻大气压力入口，找寻负压产生入口及负压的封闭系统 三、双缩脲法 原理： 碱性条件下，铜离子和多肽（至少有二个肽键，如多肽和所有的蛋白质）生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。 而真正样品中强碱标准溶液滴定 -COOH基的过程是指: PH=8.2-9.2 4.2 电位滴定法原理： 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 原理 氨基酸（酰氨键）在碱