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中和抗体试验 2008-12-15 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 目的 评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。 评价OPV的有效性和免疫效果。 适用范围 人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。 免疫成功率的监测。 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 必备材料 待检血清（灭活处理） 稀释液（MM） 细胞悬液5～10×104/ml 标准血清（WHO CDC/EPI） 标准病毒（Sabin ⅠⅡⅢ） （滴度≥106.0CCID50/ml） 必备材料 96孔微量板 微量可调式移液器 无菌吸尖/无菌吸管 无菌1.5ml离心管/试管 封板胶带 CO2孵箱 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 待检血清稀释（1∶4～1∶1024） 每份待检血清的稀释在Ⅰ型板的第1排进行。 0.15ml稀释液，加入 0.05ml的血清，吹吸均匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度移0.05ml，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去0.05ml。 （在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录1） 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 待检血清稀释 用排枪向第2排孔及Ⅱ、Ⅲ型板的相应稀释度的两排孔中，每孔移入0.025ml，原稀释孔保留0.025ml。 标准血清稀释（根据血清效价而定） standard serumⅠ: 1∶8000 standard serum Ⅱ: 1∶2000 standard serum Ⅲ: 1∶2000 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 标准毒株稀释（200CCID50/0.025ml） （病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3） 中和试验时所用抗原量过大或过小都会影响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照，核对所用病毒剂量，一般应在32～320CCID50/0.025ml的用量时其结果才被认可。 （病毒滴定对照见附录4） 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 中和作用， 向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液0.025ml （200CCID50） 。 （注意型别的区分和对应） 轻摇混匀后，放入CO2孵箱，培养2～4小时 加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔 Hep-2 : 5～10×104/ml 再次摇匀，密封好放在36.5℃培养5～7天。 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 对照的设立 血清对照（ 1∶4），标准血清和待检血清同时设立 细胞对照、稀释液对照 100CCID50的抗原对照 每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔，补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放34.5℃培养5～7天。 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 结果判定 当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定最终结果 当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度。 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 Spearsman—Karber公式： LogCCID50=Xm＋1/2d－d（?Pi/100） Xm=所用病毒最低稀释度（最高浓度）的对数 d=稀释度系数（倍数）的对数。 ∑Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和。 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 病毒滴定结果的判定 SabineⅠ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+100+25）/100=-2.75 SabineⅡ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+75+25）/100=-1.50 SabineⅢ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+50）/100=-2.00 病毒分离技术（四） ——中和抗体测定 病毒滴定对照结果的判断 SabineⅠ：取2.75的反对数，即得到攻击病毒的含量：562CCID50/0.025ml。 SabineⅡ：取1.50的反对数，即得到攻击病毒的含量：31.6CCID50/0.025ml。 SabineⅢ：取2.00的反对数，即得到攻击病毒的含量：100CCID50/0.025ml。 病毒分离技术（四）