研究丙烯酸酯的抗炎作用及抗炎初步机制.docVIP

研究丙烯酸酯的抗炎作用及抗炎初步机制 　　近年来， 炎症性皮肤病发展迅速且有逐年增高的趋势， 已成为世界上一个重要的公共卫生问题。目前，临床上广泛使用甾体类抗炎药来治疗炎症性皮肤病。但长期使用此类药物会引发皮肤萎缩、毛细血管扩张等局部不良反应，且激素外用制剂停用后皮损局部还可出现病情的反跳现象。因此寻找新的非甾体类且毒副作用小的化合物用于治疗炎症性皮肤病成为了当务之急。广泛存在于水果和蔬菜中的多酚化合物因具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多样的生理活性和较低的毒性，成为了众多研究者关注的焦点。如虎杖提取物中的二苯乙烯类多酚物质白藜芦醇可通过抑制炎症细胞因子IL-1beta;、TNF-alpha; 的释放而具有抗炎等生理活性。此外如存在于蓝莓、苹果等中的多酚肉桂酸类物质咖啡酸，可以有效抑制佛波酯(12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)诱导的小鼠耳肿胀组织中炎症因子TNF-alpha;、IL-1beta; 和IL-6 的蛋白和mRNA 表达水平。因此，前期药物筛选研究中，通过在天然肉桂酸(3-苯基-2-丙烯酸)结构基础上筛选合成了一类新的化合物，经过构效关系的研究，最终确定了以化合物(E)-苯乙基-3-(3, 5-二羟基-4-异丙基苯基)丙烯酸酯(THCA354)为代表的先导化合物。炎症性皮肤病是一种常见的由天然免疫系统的异常应答、各种炎症性细胞因子及其靶细胞(角质形成细胞)介导的复杂炎症性病理过程。银屑病、接触性皮炎等作为炎症性皮肤病中的代表，在机体应激反应早期皮肤角质层细胞大量分泌释放肿瘤坏死因子(TNF-alpha;)，它可以通过诱导相邻内皮细胞黏附分子如ELAM-1、ICAM-1 和VCAM-1 的表达加速炎症细胞浸润，同时它还可以促进IL-6、IL-1beta; 的合成和释放，加重炎症反应的进行。随着研究的深入，我们认识到皮肤角质形成细胞分泌的IL-6、IL-1beta; 和TNF-alpha; 炎症细胞因子在炎症皮肤病中扮演着重要的角色。因此抑制皮肤组织中IL-6、IL-1beta; 和TNF-alpha; 等炎症细胞因子的释放是治疗炎症性皮肤病的一个有效的策略。佛波酯诱导的小鼠耳肿胀模型由于模型稳定且操作简单等优点，是用于评价合成化合物和植物有效成分抗炎作用的最常用模型之一，在国外应用广泛。而在国内二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型最为常用，主要是因为二甲苯便宜。佛波酯诱导的小鼠耳肿胀模型具有广泛的作用机理：局部涂抹佛波酯后促使皮肤角质形成细胞产生TNF-alpha;、IL-1beta; 和IL-6 等一系列炎症细胞因子，同时也会加剧中性粒细胞的聚集，从而加重炎症反应。由于作用机理广泛，目前很多研究者都采用该模型进行合成化合物和植物有效成分的抗炎机制研究。本文基于TPA 和二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型，通过考察小鼠耳组织厚度变化值对化合物THCA354的抗炎作用进行了评价。同时测定不同浓度THCA354化合物处理和不处理的TPA 诱导的小鼠耳组织中髓过氧化酶活性，炎症因子IL-6、IL-1beta; 和TNF-alpha; 的表达，初步阐明其抗炎机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂和仪器 　　TPA、十六烷基三甲基溴化铵、3，3prime;，5，5prime;-四甲基联苯胺(美国sigma 公司);地塞米松(中国食品药品检定研究院);组织裂解液(Thermo公司);总蛋白提取试剂盒(碧云天公司);小鼠IL-1beta;、TNF-alpha;、IL-6 ELISA 试剂盒(深圳达科为公司);THCA354 化合物为自制(纯度gt;99%，批号;其他试剂均为分析纯。台式高速冷冻离心机(Neofuge);超声破碎仪(美国Sonics amp; Materials Inc);酶标仪(Beckman Coulter)。 　　1.2 实验动物 　　体质量1～18 g 的雌性Balb/c 小鼠(北京华阜康生物科技有限公司)。在温度为25 ℃、湿度为40%～70%条件下适应性喂养24 h(昼夜明暗交替条件下各12 h)，给与充足的食物和水，让其自由采食。 　　1.3 TPA 或二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型的建立及给药方法 　　将小鼠随机分组(n=10)，药物组小鼠右耳内、外均匀涂抹给予THCA354 化合物(0.3、0.6、1.2 mg/ear)，模型组给基质(20%的丙二醇/乙醇)，阳性对照组给予地塞米松(0.05 mg/ear)，健康组给予丙酮各20 mu;l。15 min 后用TPA 2.0 mu;g/ear 或者二甲苯20 mu;l 均匀涂抹于小鼠右耳内外进行致炎。给药前和给TPA 后6 h 或者给二甲苯