巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展.pptVIP

毕赤酵母中外源糖蛋白的糖基化： 酵母菌中的蛋白糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网膜内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。 糖基分为两种类型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只有甘露糖，但许多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而且糖基化位点也存在差异。N-寡聚多糖核与高等真核生物完全相同，但外侧链却有明显差异。而这种差异往往会导致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影响。 线性化重组载体 感受态菌株 平板筛选 PCR鉴定与筛选 MD和MM平板筛选 筛选多拷贝外源基因转化子 G418 表达鉴定与筛选 mRNA水平 蛋白表达水平 高效表达种子工程菌 发酵罐工艺建立 Muts和Mut+ 技术路线： 根据启动子的特性选择 甲醇诱导型启动子如PAOX1 ，但甲醇易燃，也不适用于食品生产，这时可选择PGAP,但不宜用于表达对宿主有毒的蛋白。 强启动子可能产生无功能的蛋白 由于超过宿主自身翻译后修饰加工的能力，引起蛋白的错折叠、不加工或错定位。这是可选用较温和的启动子如PPEX8(一种过氧化物酶体基质蛋白启动子)。 启动子的选择 目的基因的碱基组成 基因富含A+T，会导致转录提前终止 种属特异性影响 稀有密码子制约翻译速率 此时需要进行全基因的合成，使编码序列符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的G+C含量。 目的基因特性 相对剂量效应 一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。 过高表达对分泌途径抑制 对于分泌蛋白，过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制 基因剂量 UTR对蛋白表达的影响主要表面在mRNA的翻译水平上， 目的蛋白mRNA5’UTR应尽可能与AOX1mRNA相同。 Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5’UTR相同后表达水平提高50倍以上。 mRNA5’非翻译区 毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。 解决糖基化策略： 尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化； 对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基化； 共表达糖链加工酶，使糖链结构接近哺乳动物，从而降低抗原性。 翻译后修饰 表达产物的稳定性 解决外源蛋白降解的三条基本途径： 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以减少对目的蛋白的降解； 调节培养基PH值抑制蛋白酶活性； 使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、 SMD1165等 温度：必须选择合适的温度。温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，但温度过高，又会使酶易因热而失去活性。 pH值：毕赤酵母生长的pH值范围比较宽，因此应当选择适宜外源蛋白表达的pH值。 溶氧量：甲醇代谢过程中需要消耗大量氧，因此在发酵过程及时补充毕赤酵母代谢所需要的氧气对于外源蛋白表达量是至关重要的。 甲醇的浓度和监测：在发酵过程中，需要定期补加一定量的甲醇以补偿甲醇的消耗和挥发。一般液体培养时，补加甲醇的终深度达到0.5%即可。但具体情况需要根据试验而定，同时可以根据溶氧和气象色谱控制甲醇流加。 发酵条件 近年来，毕赤酵母表达系统应用的范围越来越广，自20世纪80年代初到现在，人们已经用毕赤酵母表达体系成功表达了500多种蛋白，包括疫苗，激素、干扰素、抗菌肽、酶、膜受体蛋白等。但毕赤酵母表达系统也存在着一些问题，如蛋白的糖基化程度比哺乳动物偏大，影响蛋白的功能，另外，分泌产物表达不均一，信号肽加工不完全，表达产物降解等，这些都一定程度上限制了毕赤酵母的应用。 但随着对发酵工艺的不断完善和对巴斯德毕赤酵母的深入研究，相信它将会成为表达外源蛋白的有力工具，充分发挥其在生物技术领域尤其是基因工程产品产业化方面的应用潜力。 11、机智应变的猴子：工作的流程有时往往是一成不变的，新人的优势在于不了解既有的做法，而能创造出新的创意与点子。一味 地接受工作的交付， 只能学到工作方法 的皮毛，能思考应 变的人，才会学到 方法的精髓。 12、善解人意的海豚：常常问自己：我是主管该怎么办才能有助于更好的处