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腺病毒载体的构建 　　病毒是一种无包膜的双链DNA 病毒，分子量为150 MDa，直径约为950 ，它是已知最大和最复杂的无包膜DNA 病毒之一。腺病毒广泛存在于自然中，能通过呼吸道、消化道、眼黏膜等途径感染动物和人，无论增殖和非增殖细胞均可以被感染，但对人类的致病性低。由于腺病毒和人类基因组同源，感染后不会整合到人染色体中，不会导致染色体突变。因此，将腺病毒作为抗原呈递载体构建疫苗，具有高效、安全、给药方便的优点，可以激发机体天然免疫反应，同时便于保存及成本易控，这些优势使得腺病毒载体成为疫苗研究的热点。同源重组方法构建腺病毒载体是目前公认的效率较高的方法，但由于受到36 Kd 腺病毒DNA 碱基数量过大影响，实际效率不高。Gibson Assembly 方法是近些年由Dr. Daniel Gibson 发明了一种新的方法，可以容易的将多个线性DNA 片段组合到一起。本研究采用传统同源重组与GibsonAssembly 两种方法对腺病毒载体进行构建，并做出对比与评价。 　　1 材料和方法 　　1. 1 主要材料 　　质粒pBR322、大肠杆菌DH5alpha;、大肠杆菌DY330、E1 区、E3 区、蛋白IX 缺损的4 型腺病毒以及Hela229 细胞由中国军事医学科学院8 所提供，经PCR 及酶切鉴定无误。质粒提取试剂购买于威格拉斯公司，电击仪、1 mL 电击杯购于Bio-Rad MicropulserTM 公司，Gibson Assembly Mix 试剂购买于NEB 公司，Q5 Taq 酶购买于NEB 公司，限制性内切酶购买于宝生物公司。 　　1. 2 实验方法 　　1. 2. 1 腺病毒感染繁殖和DNA 提取E1 区、E3区、蛋白IX 缺损的Ad4 感染入Hela229 细胞，10%胎牛血清EMEM 37 ℃温箱培养72 h，使病毒在细胞内增殖。反复冻融数次，破坏细胞壁后收集至20 mL 超滤管5 000 g 离心30 min，使含有病毒的培养液浓缩。加入Baffer A 2 mL( 100 mmol /LTris、150 mmol /L NaCl、12. 5 mmol /L EDTA) 到20 mL超滤管5 000 g 离心，反复洗涤4 次后加入等体积Baffer B( 100 mmol /L Tris、150 mmol /L NaCl、12. 5 mmol /L EDTA、2% SDS) 及1 /50 体积蛋白酶K，50 ℃反应30 min。酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到纯净的DNA。- 80 ℃冰箱保存备用。 　　1. 2. 2 同源重组方法构建腺病毒载体 　　1. 2. 2. 1 腺病毒载体质粒骨架( pBR - 4VLR) 构建pBR322 质粒用限制性内切酶HindIII 切成线性。用PCR 扩增两条同源壁，一端( 40 bp) 与pBR322 同源，另一端与AD4 两端同源。左臂长974 bp，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTG，下游引物GACGAGCAGGCGATTCAGAAC;右臂长853 bp，上游引物GCCTCAGGAACAACGATGGAA，下游引物CACAAAAAAAATAAGGTATATTATTGATGA。在DY330 中同源重组，使同源臂链接在pBR322 上。 　　1. 2. 2. 2 打靶感受态制备取5 mu;L DY330 细胞接于5 mL无抗性培养液中，30 ℃ 摇床增殖12 ～16 h。取增殖后的菌液300 mu;L 加入15 mL LB， 30 ℃摇床培养2 h，42 ℃ 水浴摇床培养12 min，冰浴30 min，用离心机7 500 r /min 和无菌水在4 ℃条件下洗涤3 次。10%甘油重悬1 mL，4 ℃ 12 000 r /min离心机中再洗涤1 次，10%甘油200 mu;L 重悬。 　　1. 2. 2. 3 同源重组取40mu;L 感受态细胞、AD4DNA10 ng 和pBR-4VLR 1. 5 ng 于电击杯中，电击仪电击。电击打靶条件: 电压1. 5 kV，电阻300 Omega;，电容2. 5 mu;F。加入无抗LB1 mL 稀释，取出500 mu;L涂琼脂平板，置入30 ℃温箱培养过夜，挑平板中单菌落作鉴定。 　　1. 2. 3 Gibson Assembly 方法构建腺病毒载体 　　1. 2. 3. 1 原料扩增pBR322 为载体骨架，将3. 6 kb的AD4 DNA 分成AD-1、AD-2、AD-3、AD-4 4 段，均用PCR 方法扩增，5段原料两侧均设计30 bp 左右的同源臂。pBR 322 段(2kb) : Q5Taq，上游引物ATTATTGATGATGCGAT