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谈HPLC 法同时测定小鼠血浆中3 种银杏酸单体的浓度 　　银杏酸是银杏的叶、果和外种皮中除黄酮、内酯外又一类活性成分。在细胞和动物实验中，银杏酸显示出的优异抗肿瘤作用，主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现。银杏酸可直接作用于细胞线粒体，使其外膜电位下降，活性氧含量升高，进而影响其功能而导致细胞凋亡。因此，人们认为银杏酸是一种具有良好前景的抗肿瘤药物，值得深入研究。 　　银杏酸( ginkgolic acid，GA) 为银杏中6-烷基或6-烯基水杨酸衍生物的统称，主要由GA 13 ∶ 0，GA15 ∶ 0，GA 15 ∶ 1，GA 17 ∶ 1 和GA 17 ∶ 2 等5 种单体组成 ，其中GA 13 ∶ 0，GA 17 ∶ 1 和GA 15 ∶ 1这3 个单体占银杏酸总含量90%以上。由于银杏酸各单体的侧链长度及双键数均不相同，其抗肿瘤活性亦有明显的差异。Lee 等研究发现，在银杏酸体外抑制A-549、MCF-7、HCT-15、HT-1197 等肿瘤细胞生长实验中，以GA 17 ∶ 1 的抑制作用最强，GA 15 ∶ 1 次之，GA 13 ∶ 0 较弱，因此有必要对各个单体分别进行研究。 　　前期我们建立了银杏酸同系混合物的浓度在小鼠血浆中的高效液相色谱( HPLC) 测定方法，并测定了小鼠静脉给药后血浆中5 个银杏酸浓度总和与时间的关系。为了更好地进行银杏酸主要单体药效学研究，本文拟建立测定小鼠血浆中银杏酸3个主要单体GA 17 ∶ 1，GA 15 ∶ 1 和GA 13 ∶ 0 的HPLC 法，同时对小鼠单剂量( 100 mg·kg - 1 ) 尾静脉注射银杏酸后，血浆样品中GA 17 ∶ 1，GA 15 ∶ 1和GA 13 ∶ 0 的浓度进行测定。 　　1 材料与仪器 　　ProStar 高效液相色谱仪( 美国Varian 公司) ;Star 色谱工作站; Mettler AE-240 型电子分析天平( 上海梅特勒-托利多仪器有限公司) ; SK-1 型快速混匀器( 江苏金坛医疗仪器厂) ; TGL-16 高速台式冷冻离心机( 湘仪离心机仪器有限公司) 。银杏酸同系混合物( 含量gt; 98%) 及GA 13 ∶ 0，GA 15 ∶ 1 和GA 17 ∶ 1 单体对照品( 纯度gt; 97%) 由本实验室制备。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子双蒸水。清洁级昆明种小白鼠102 只，体质量18 ～ 22 g，雌雄各半，由江苏大学实验动物中心提供，合格证号: SCXK( 苏) 2009-0002。 　　2 方法 　　2. 1 色谱条件 　　银杏酸单体纯度验证采用安捷伦ZORBAX EclipseXDB-C18( 150 mm times;4. 6 mm，5 mu;m) 色谱柱。银杏酸同系物及血浆中银杏酸单体分析采用SinoChromODS-AP C18柱( 250 mm times;4. 6 mm，5 mu;m) 色谱柱，串联大连依利特佳杰C18保护柱( 4. 6 mm times;10 mm，5 mu;m) 。流动相为甲醇-3%醋酸( 92 ∶ 8) ，流速1 mL·min - 1，柱温40 ℃，紫外检测波长310 nm，进样量为20 mu;L。 　　2. 2 血浆样品处理 　　取0. 2 mL 小鼠血浆，加入0. 5 mol·L - 1 盐酸100 mu;L，混匀1 min，再加入0. 8 mL 乙腈沉淀蛋白，混匀2 min，于4 ℃离心10 min，3 500 r·min - 1，上清液用氮气吹干，残渣用200 mu;L 甲醇复溶，于4 ℃10 000 r·min - 1 离心10 min，0 . 45 mu;m 针头滤器过滤后进样，外标法定量。 　　2. 3 检测方法的验证 　　2. 3. 1 专属性考察通过比较空白血浆样品色谱图、加入银杏酸单体的血浆样品色谱图和银杏酸同系混合物尾静脉给药后获得的小鼠血浆样品色谱图，评价方法的专属性。 　　2. 3. 2 线性关系考察分别准确称取一定量GA13 ∶ 0，GA 15 ∶ 1 和GA 17 ∶ 1 对照品加甲醇溶解并定容，依次配制成质量浓度分别为280，440，220g· mL - 1的储备液，再依次稀释成系列质量浓度的对照品工作液备用。于0. 2 mL 小鼠空白血浆中加入对照品溶液，依次分别按“2. 2”方法操作。以各分析物浓度为横坐标( X) ，分析物峰面积为纵坐标( Y) ，最小二乘法回归分析，求银杏酸3 个单体的回归方程。将日内和日间分析变异系数和准确性均小于20%的最低质量浓度定义为最小定量限度( lower limit of quantification，LLOQ) 。 　　2. 3. 3 精密度与准