实验十二离子交换柱层析分离核苷酸.docVIP

实验八 离子交换柱层析分离核苷酸 一、实验目的 本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。 本实验的目的是： 1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3. 熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理 1. RNA的碱水解 实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合物；用5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解则分别可得到5一核苷酸或3一核苷酸。 RNA用碱水解，经过2、3一环核苷酸中间物，而后水解生成2一核苷酸和3一核苷酸。如下图所示。 碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴