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应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母GS115 中的表达量 姓名：夏永仙 学号：3110102 专业：微生物 日期：2011-12-4 1.毕赤酵母表达系统优点 1.含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 2.表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使 表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化 3.发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高 密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/L以上， 表达重组蛋白时，已成功放大到10000L 4.培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖 5.外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失 2.概括内容： 通过同源重组的方式分别在毕赤酵母基因组 HIS4 位点与 AOX1 位点整合pPIC9K 和 pPICZαB，实现在同一宿主菌中的共表达，从而提高标蛋白在毕赤酵母中的基因剂量，在一定范围内以提高目标蛋白的表达量 表达载体主要分类 (1) 胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。 (2) 分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P 等。由于毕赤酵母本 身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌 到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及 积累。 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式 通过转化 DNA 与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有 HIS4 基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化 以后，可在 AOX1 或 his4 位点进行同源重组， 从而产生 HIS+重组子。 1）基因插入 AOX1 或 aox1::AGR4 位点 2）基因插入 His4 位点 3）多拷贝插入表达载体如 pPIC9K，pPIC3.5K 3.实验方法及结果1) 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建 pPIC9K-ggh 3.实验方法及结果2)重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞 3.实验方法及结果3) 免疫斑点法筛选高表达菌株 ①将菌落转移到醋酸纤维素薄膜上 ②在 BMMY 平板上置同样大小的 0.22 μm 的硝酸纤维素薄膜，将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤维素薄膜上，30 ℃培养 80 h，上层醋酸纤维素薄膜转移至 MD 平板上，4 ℃保存 ③下层硝酸纤维素薄膜取出，5％脱脂奶封闭 2 h ，用TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。用兔抗人血清白蛋白多抗 37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。 用二抗结合，37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min， 重复 3 次。加入新鲜配置的 DAB 显色液，染色 5 min 后用 TBST清洗，挑选出染色颜色较深的 菌落进行摇瓶培养和诱导。 3.实验方法及结果4)诱导表达及表达产物分析 挑取膜上颜色由深到浅的单菌落接种于 10 mL的 YPD 培养基，培养 24 h，5％接种量转接到装有60 mL 含 3％甘油的 BMGY 培养基的 500 mL 三角瓶中，初始 OD 600 为 1，30 ℃、120 r/min 振荡，24 h 后离心收集菌体，用 20 mL 含有 3％甲醇的 BMMY 培养基重悬菌体后诱导表达，甲醇诱导 80 h 后OD 600 约为 200，10000 r/min 离心 10 min，收集上清，用尿微量白蛋白试剂盒测发酵上清液中的目的蛋 白 含量，发 酵 液 离 心 后 取 上 清 等体积 进 行SDS分析 3.实验方法及结果4)诱导表达及表达产物分析 3.实验方法及结果5)重组毕赤酵母基因组的提取和 PCR鉴定阳性克隆 提取高产菌 GS115/F 3 和出发菌株 GS115/F 2 的基因组 DNA，加入 RNase A 消除 RNA 的干扰。以pPICZα