基因克隆的载体.ppt

RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. M13载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。 噬菌体P1基本特征： 不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。 溶源噬菌体的诱发： 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。 二、λ噬菌体载体 λ phage 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends) 溶菌阶段 (复制和释放) 溶源阶段 (整合到寄主染色体上) A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N COS COS 头部基因 尾部基因 功能不明区 溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌 生长非必须区段 cI基因：溶源过程控制基因。 λ噬菌体的基因组结构 DNA Protein coat cos cos Nonessential region Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (~20-23 kb) λ phage 12bp 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-3’ 5’-CG + GC-5’ 3’-GCCCCGCCGCTGGA The phage ? cos ends Circular form Linear form Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends) λ phage Lytic phase (Replicate and release) Lysogenic phase (integrate into host genome) λ噬菌体载体的主要类型 1. 插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。 2. 替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 3. 凯伦噬