电镜技术及超薄切片技术(研究生).ppt

电镜酶细胞化学技术 电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术。酶存在的特定位置称为酶的定位。主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶，有100多种。 注意：在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。 以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。 在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3‘二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。 脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。 酶细胞化学的常规操作流程 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定 液，常用的缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以 用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内， 在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵