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现代遗传学研究方法 DNA体外重组技术 PCR技术 植物DNA提取 RNA的提取及定量检测 Southern Blot 荧光定量PCR 实验设计 所需的各种DNA片段及其排列次序 （设计图纸） ORF 酶切位点（施工方案） 实验方法和操作（施工） 通过克隆载体引入酶切位点 部分酶切 克隆的先后次序 质粒DNA的提取 采用碱变性小量提取法： 挑取单菌落，加5ml含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养过夜。 将菌液加入1.5ml离心管，4000r/min，离心5min，尽可能弃去上清。 加100μL溶液Ⅰ，强烈振荡至细胞均匀分散，室温放置5min。 加200μL溶液Ⅱ，颠倒混匀，动作要轻，冰浴5min。 加150μL溶液Ⅲ，颠倒2~3次混匀，冰浴5min。 4℃，12000r/min，离心10min，将上清移至新管，小心不要将沉淀吸入。 用等体积苯酚∶氯仿抽提。4℃，12000r/min，离心5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚∶氯仿。 加两倍体积95%的冰乙醇，颠倒混匀，4℃，12000r/min，离心10min。 用70%乙醇清洗沉淀。 倒掉乙醇，吹干。 加入适量TE溶解 电泳检测。 酶切与回收 双酶切体系的建立 DNA的质量 凝胶重量 回收片段的质量 连 接 连接体系 载体和DNA片段的大小 PEG的添加 连接条件：温度 转化子的鉴定 PCR技术 引物设计的原则（一） ①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物设计的原则（二） ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带（热启动PCR）。 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物设计的原则（三） ⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 对于比较复杂的实验，多设计几对引物配合使用时很有效的（巢式PCR）。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。（梯度降落PCR ） 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸时间： 根据所用Taq酶种类和待扩增片段长度而定 使用有校读功能的酶应延长延伸时间； 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min就足够了； 3～4kb的靶序列需3～4min； 扩增10Kb需延伸至15min。 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 生命科学学院遗传学教研室 课 程 目 录 快速扩增cDNA末端，RACE 酵母单杂交系统 PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences 基因的体外分子进化 基因原核表达 毕赤酵母表达系统 拟南芥实验操作 蛋白质分离纯化与检测技术 DNA体外重组技术 酶切位点 通过克隆载体引入酶切位点 通过PCR引入酶切位点（需测序） 部分酶切 Adaptor的使用 克隆的先后次序 Adaptor的使用 通用植物表达载体pBHT-5的构建 SfiA SfiB 克隆位点的引入 衔接头设计 BS1: 5’-GA