2016年牛粪和食用菌渣等农业废料规模化生产鲜蚯蚓研究项目技术报告.docVIP

技术报告 一、立题依据及指导思想 近20年来，随着我国畜牧业的繁荣和发展，国内畜禽的饲养环境与饲主的饲养观念以及生产成本高涨的压力下，密饲已成为不正确的趋势，加上卫生管理上的缺失，疾病的发生日趋复杂化，兽药(包括药物添加剂)的使用日益广泛，兽药的使用无疑会导致兽药及其代谢产物在动物体内的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。兽药残留问题不仅涉及到广大人民群众的生命安全与健康，还涉及到生产经营企业的经济利益和国家经济的发展。去年以来，各地多宝鱼事件、红心鸭蛋事件、瘦肉精中毒等食品安全事件频发，食品安全问题导致我国农产品、食品国际贸易屡次受阻，损害了出口信誉和国家形象。目前，中国的食品已经出口到全球２００多个国家和地区。２００６年中国出口食品２４１７.３万吨，货值２６６.５９亿美元。近期，宠物食品和食品安全事件的出现，使中国的产品质量和食品安全状况备受关注。随着我国经济的发展和社会的进步，食品生产经营和消费格局的变化，以及经济和贸易的全球化，食品安全监管工作面临一些新形势。公众对食品安全的关注度将继续增加，食品安全事件极易引起全社会的广泛关注。 要提高畜禽产品的质量，确保畜禽产品的安全，除了严格控制疫情、加强饲养管理和对兽药及添加剂残留的监测与控制外，开发出新型的可替代抗生素的抗菌肽饲料原料和添加剂至关重要。由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。抗生素作饲料添加剂严重影响畜产品在国际市场的竞争力，应用生物技术研究与开发新型抗菌剂是我国科学界一项紧迫的任务。 本项目用牛粪和食用菌渣等农业废料通过发酵处理成蚯蚓喜食的饵料，规模化生产鲜蚯蚓。将收集到的鲜蚯蚓用超声诱导技术诱导蚯蚓抗菌肽的高表达。然后将超声处理抗菌肽高表达的蚯蚓匀浆后离心, 用超滤的方法截留分子质量小于1 ku的粗组分。经过超滤截流的粗组分用阳离子交换剂SP-Sepharose Fast Flow和蛋白质液相色谱(FPLC)分析Pharmarcia FPLC系统收集抗菌肽，并得到纯化的抗菌肽。纯化的抗菌肽用电喷雾离子源质谱(ESI-MS)测其分子质量及纯度。接着用串联质谱(MS/MS法， Bruker ESQUIRE-LC/MS液相色谱-质谱联用仪)测定抗菌肽的氨基酸序列，用水将样品溶解后直接上样,电喷雾离子源，测定其的氨基酸序列。抗菌谱检测用微量稀释法，参照天津金章医用新技术研究所MIC试剂盒说明书。通过上述检测完成对蚯蚓抗菌肽的定性、定量和抗菌活性结构分析。然后将表面活性剂、助表面活性剂、油、水、抗菌肽等组分在适当条件下，形成油包水型（W/O）的外观透明、低粘度，热力学稳定体系抗菌肽微乳液。 考虑生产成本和市场化问题，因为蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶如蚯蚓纤溶酶,这些蛋白酶类对蛋白质有较强的水解活性,可使蛋白质发生水解作用,选择适宜的酶解条件,使蚯蚓体内酶保持较高活性,并利用这些酶水解体蛋白,使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,作为添加剂可以直接被其它动物体完整地吸收,发挥其促生长及抗病的作用。为了进一步利用蚯蚓营养肽,本研究对蚯蚓营养肽的性质及功能进行了深入研究,以研究其促进动物生长及防病的机理,并为其进一步的开发利用打下基础。 以蚯蚓生态链为核心，创立肉牛生态养殖新模式，形成高效的肉牛-牛粪-蚯蚓-蚯蚓抗菌肽-有机肉牛生产生态链并延伸成产业化链，开发出无毒无公害的新型促进动物生长及防病的蚯蚓营养肽作为饲料添加剂。 二、课题研究的主要内容 1.主要技术路线 2、创新点 利用微乳化技术处理抗菌肽，制备的抗菌肽微乳液，微乳液粒径大小都在10-100 nm以下，形成纳米级的抗菌肽微乳液粒，有利于动物机体吸收。且粒径大小随时间变化不大，稳定性好，制备简单，常温下贮藏，微乳化的抗菌肽损失随时间变化很小。抗菌肽通过微乳化形成油包水的微乳液粒，使其免受胃蛋白酶等消化酶的酶解作用，还有胃酸的腐蚀作用。 利用蚯蚓消化道中有10多种蛋白水解酶，可使蚯蚓本身蛋白质发生水解作用,使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,开发出促生长及抗病的蚯蚓营养肽。 3、本研究的主要难点在于 ⑴ 对蚯蚓利用工程菌采用超声技术进行抗菌肽高表达诱导。 采用诱导方法制取蚯蚓抗菌寡肽，这是一条与“基因工程”方法制取抗菌肽完全不同的途径,对发展生物制药具有重要意义。 ⑵ 抗菌肽的超滤和提取。 用超滤法与离子交换层析相结合的蚯蚓抗菌肽制备方法，简便易行、收获率和纯度高,从蚯蚓