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研究生课程论文 题目：PCR-DGGE在真菌研究中的应用 学 院 生命科学学院 课程名称 植物学科研究进展 专业年级 植物学2014级 学 号 姓 名 成 斌 2015年 1月 20日 PCR-DGGE 在真菌研究中的应用 成 斌 （河北大学 生命科学学院 河北 保定 071002） 摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）DNA，选取5′端含GC夹的特异性引物对18S rDNA或IST序列等的部分片段进行扩增，得到合适的目的DNA片段，并在变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使不同来源的真菌DNA片段有效分离，再进行各种分类分析。 关键词:PCR-DGGE；变性梯度凝胶；真菌；引物；DNA 丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)在自然界分布广泛,能够与80%以上的陆生植物形成共生体[ 1 - 2 ] 。它能够提高植物抗旱性、抗病性,促进生长,提高产量,改善作物矿质营养,被誉为“生物肥料”[ 3 ] 。由于AM真菌至今仍然不能被纯培养,给菌种鉴定、遗传学以及群落生态学研究等带来不少难题[ 4 ] 。随着分子生物学技术的不断发展,各种分子技术已被应用到AM真菌研究中。目前,国外已在这一领域进行了大量的探索和研究,而国内在该领域研究则进展缓慢[ 5 ] 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）DNA 分离[8]。变性梯度凝胶电泳技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术[ 7 ] 。后来,该技术逐渐被应用于微生物生态学研究,并证实了这种技术在研究自然界微生物群落结构变化、遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性,并且该方法能够较准确地反映出环境样品中优势种群的动态变化规律[ 8 - 9 ] 。目前,在原核生物生态学研究中DGGE技术已发展的较为成熟。然而,将其应用于真核生物生态学研究的报道,并不多见[ 5 ] 。 1 样品DNA的提取 从样品中提取DNA 的产率，直接决定了DGGE 条带的代表性[14]。DNA 产率低，其条带的代表性就差。真菌分布广泛，种类繁多，为获得较高的DNA 提取产率，DNA 提取方法也需要根据样品的特性具体分析，寻找针对性较强的处理方法。 1.1 土壤样品中真菌DNA 的提取 对于土壤样品DNA的提取，通常会采用改良后的Bead-Beating 法[5]10 g土样，放入盛有数粒无菌玻璃珠（直径3～5 mm15 mL 提取缓冲液；在180 r/min，37荡30 min后，加2 mL 20% SDS 继续振荡10 min；65℃水浴1 h后，6 000×g离心15 min；收0.5倍体积PEG (30%) -NaCl(1.6 mol/L)，混匀后室温下静止2 h，在10 000×g离心20 min，沉淀用2 mL TE重新悬浮；加4 mol/L NaAC至终浓度0.3 mol/L，用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，0.6倍体积异丙醇沉淀2 h，12 000 ×g离心20 min200 μL TE 溶解，经纯化后，-20℃保存。 1.2 液体样品中真菌DNA 的提取 对于液体样品，需要首先进行离心，将收集的沉淀物重新溶解后，即可进行DNA 提取操作。对于DNA提取前的预处理，可选用常规方法，如机械研磨法、酶解制备原生质体法、氯化苄法等[15]，需根据不同样品的具体特征进行选择。 DNA 提取完毕后，可以通过电泳进行检查，或者利用紫外可见分光光度计检查DNA 的纯度[14]。如纯度不够，可以利用纯化试剂盒做进一步的纯化。 1.3 丛枝菌根样品中真菌DNA的提取 丛枝菌根真菌在自然界分布广泛，大量存在于农田、森林、沙漠、煤渣、盐碱地、贫瘠土壤等生态环境中，能够侵染约80%的陆生植物[16]，与根系共生形成丛枝菌根。丛枝菌根真菌DNA 的提取，可以Saito 等[17]开发的方法为基础，稍加改进即可获得较为理想的效果。基本过程为：取丛枝菌根样品1.5 g 左右，冲洗干净后剪成约0.5 cm 长的碎段放入研钵中，加入约1.0 g 石英砂，充分研磨，加4 mL 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0）入10 mL 离心管中；沸水浴15 min，8 000×g 离心15 min，4 mol/L NaAC（pH5.4）0.3 mol/L，0.6 2 h，14 000×g 10 min，弃上清液；沉淀物用1mL 70%乙醇漂洗一次；用100 μL -20℃保存。 1.4