人粒细胞无形体病实验室检测方案.doc

人粒细胞无形体病实验室检测方案（试行） 表1巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物引物名称 序 列 片段(bp) Eh-out1(AF414399) 5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’ 653 Eh-out2(AF414399) 5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’ Eh-gs1(AF414399) 5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’ 282 Eh-gs2(AF414399) 5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’ HGA1 5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’ 389 HGA2 5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’ PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10μl（白细胞提取的DNA可适当减少）。PCR反应体系总体积为25μl或50μl（需要进行PCR测序或克隆时，应适当扩大反应体系），其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下： 94℃ 5min 40循环：94℃ 45sec 55℃ 50sec 72℃ 1min 72℃ 总延伸 5min 第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA种特异性引物（HGA1及HGA2）。检测样本取第一轮产物1-2μl为模板，阳性对照取0.5μl为模板。反应程序同第一轮反应。 （2）热休克蛋白基因groEL扩增 与groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR，引物序列见表2。 表2 groEL基因扩增常用引物 序列 退火温度 片段bp) HS1 5’-TGG GCT GGT A（A/C）TGA AAT 52 1431 HS6 5’-CCI CCI GGI ACI A（C/T）ACC TTC HS43 5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC 55 HGA480 HS45 5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC HME528