2-DNA测序原理概要.ppt

2、DNA测序原理 Sanger 测序－－双脱氧末端终止法 双脱氧末端终止法 DNA测序循环反应与普通PCR扩增的区别 测序只用一条引物；PCR需两条引物 测序产物线性扩增；PCR产物指数扩增 测序需要dNTP和ddNTP ；PCR只用dNTP 测序产物是长度相差一个碱基的一系列片段；PCR产物是长度相同的一种片段 基因分析仪的基本构造 ABI公司20年研发制造经验，书写基因分析仪历史！ ABI公司基因分析仪发展历史 1986年 370型 全世界第一台基因分析仪 1991年 373型 基因分析仪 1995年 377 型 基因分析仪，光栅+CCD 310型 毛细管基因分析仪 1997年 377-96 基因分析仪 1998年 3700型 96道毛细管基因分析仪 2000年 3100 16道毛细管基因分析仪 2002年 3100 Avant 4道毛细管基因分析仪 2002年 3730 48道毛细管基因分析仪 3730xl 96道毛细管基因分析仪 2004年 3130 4道毛细管基因分析仪 3130xl 16道毛细管基因分析仪 2007年10月 新一代超高通量序列分析仪SOLiD… … 全世界约2万台，中国800台，市场占有率85% 双侧荧光激发双束激光两侧同时激发：灵敏度+均匀性+超速测序 信号收集方法比较 ABI测序试剂使用同样的反应条件，适于所有ABI测序仪 BigDye? v3.1 和 v1.1 试剂盒 DNA测序和片段分析软件大家族 Data Collection 仪器控制和数据收集 Sequencing Analysis 测序数据处理 SeqScape 序列比较，寻找突变 MicroSeq ID 细菌真菌鉴定 SeqScanner 测序数据阅读（免费软件） 谢 谢 * 现在只有1.1和3.1 sequencing difficult dinucleotide repeats (CT repeats in particular) and homopolymer regions. Fred Sanger 弗雷德·桑格尔 Leroy Hood 莱诺伊·胡德 DNA分子组成 Adenine Guanine Cytosine Thymine 碱基 戊糖（脱氧） 磷酸 脱氧核糖核苷酸dNTP 脱氧核糖核苷 A C G T unlabeled primer template DNA + dATP, dCTP, dGTP, dTTP ddCTP ddATP ddGTP ddTTP ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3`-OH已被氧化，下一个dNTP的5`-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同长度的新的DNA片段。 DNA sequencing: Chemistry template + polymerase + dCTP dTTP dGTP dATP ddATP ddGTP ddTTP ddCTP extension electrophoresis A?T G?C A?T T?A C?G T?A G?C G?C A?T G?C T?A T?A C?G T?A G?C A?T DNA测序的自动化 高压电源 CCD 相机记录所有通道信号 激光激发所有通道 计算机分析测序数据 激光源 毛细管 电泳方向 毛细管 进样端 检测窗口 信号 DNA测序示意图 C T T G C A T G A C 序列 用点的大小代表DNA分子的大小， 颜色代表DNA所标记的颜色。 DNA测序的设备 1986年全球第一台基因分析仪 370 373 377 3100(A) , 3130（xl） 310 3730(xl) 1996年全球第一台毛细管基因分析仪 平板胶电泳 毛细管电泳 377(36/96) 310