2014年实验课总结概要.ppt

存在问题： 有个别组出现鸡蛋清溶液的茚三酮反应不明显或不显色的现象。 同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸性或碱性过大时甚至不显色。 鸡蛋清溶液在稀释后存放过程中pH逐渐变大，大于8.0，导致不能发生茚三酮反应。 当蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（isoeletric point），以pI表示。 处于等电点时，蛋白质分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，此时蛋白质溶解度最小。 存在问题： 个别组量取溶液的量不够准确，导致试管中溶液的pH 不准确，所以酪蛋白聚沉出现沉淀最多的试管序号发生偏移。 一定要掌握量器的使用方法！ 存在问题： （1）个别组硼酸试剂污染 没有按着要求使用移液管，用量取氢氧化钠的移液管量取硼酸，使硼酸收碱污染，pH过高，滴入甲基红指示剂后，颜色为绿色。 （2）蒸馏仪洗涤不干净 比如：硼酸指示剂颜色为接近绿色，就不再洗涤。 （3）某些组没有真正理解实验的原理，对操作过程一知半解。 有些组蒸馏样品时，只机械地记住了蒸馏多长时间，而不观察蒸馏过程中的现象。 实际上由于酒精灯火焰的漂移，内室的样品早已经排出到外室，即使蒸馏再长时间，硼酸接受瓶的体积不会变大，实质上没有吸收多少氨，导致滴定值偏小。 存在问题： 个别组展层剂配制错误！导致样品没有迁移出点样点或迁移距离太小。准确量取溶液尚需加强训练！ 个别组点样时太轻，以致于点样量太少，层析显色完成后几乎看不清层析点的轮廓。 实验五 Folin-酚法测定蛋白质浓度 蛋白质浓度测定： 物理化学性质－－如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知； 化学方法－－如凯氏定氮、双缩脲反应、Fo1in—酚试剂法（Lowry法） ，考马斯亮蓝法（Bradford法 ）等方法 双缩脲法和Fo1in－酚法是实验室中经常使用的方法。 Fo1in—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。 Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成: 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成（碱性）. 乙试剂由磷钼酸和磷钨酸组成（在碱性中极不稳定）. 反应过程分为两步： 首先，在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的?Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+?复合物. 然后，蛋白质-Cu2+?复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原乙试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物（钼蓝和钨蓝混合物）。 定量关系: 在一定蛋白质浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质含量呈线性关系，所以，可用比色的方法确定蛋白质的含量。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 存在问题： 标准曲线的制作： 根据得到的直线方程，将测定的未知蛋白质的吸光度值代入，计算蛋白质的含量。 存在问题 若用Na2S2O3标准溶液滴定析出的碘时所消耗的量太少（约几滴的量），那么，说明在暗室反应时没有加入硫酸酸化，碘析出的量太少造成的。 如果滴定时消耗的硫代硫酸钠的体积低于3mL或高于6mL，那就说明酶促反应生成的葡萄糖的量太多或太少。因此，我们重新进行酶促反应时需要对最初的酶液进行稀释来降低酶的浓度或者减少稀释倍数提高酶的浓度。 制作酶活力-温度曲线图时,不能添加趋势线,而选择……横坐标不能太长,纵坐标不能太短. 注意事项： 调节RNA等电点时，必须在2.5-3.5之间. RNA粗品 提取失败的样品 SDS电泳中，制备样品时煮沸3分钟，主要目的是让SDS与蛋白质充分结合，使蛋白质充分变性，消除蛋白质本身所带电荷的差异及分子形状的差异，使蛋白质分子在SDS－PAGE中迁移率只与蛋白质的亚基的相对分子质量成正比。 样品缓冲液各成分的作用：含有SDS（变性剂）、巯基乙醇（还原剂，可以将二硫键打开）、甘油（点样时使蛋白质样品下沉进入点样孔中）、溴酚兰（分子量很小，可以用来指示电泳的前沿）。 实验八 温度对糖化酶活力的影响 糖化型淀粉酶能催化淀粉分子从非还原型末端开始，水解α-1, 4糖苷键生成葡萄糖。反应生成的葡萄糖可用次碘酸盐法定量测定，以表示糖化型淀粉酶的活力。 次碘酸盐法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。 酶促反应液中加入过量的碘，I2与等量的NaOH作用可生成次碘酸钠（NaIO），次碘酸钠可将反应液中生成的葡萄糖（C6H12O6）分子中的醛基氧化为羧基。 多余的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI和NaIO3，酸化时NaIO3又恢复成I2析出。 用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2。依据不同样品消耗Na2S2O