miR-155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动.ppt

miR-155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动 汇报人 摘要、前言 方法、结果 文本 摘要 HGAL是弥漫性大B淋巴瘤和霍金斯淋巴瘤的病人的预后指标 靶向结合 miR-155 RhoA actin HGAL 肿瘤转移 细胞运动 前言 HGAL:淋巴生发中心特殊基因，至少通过2个分子机制参与了淋巴细胞和淋巴瘤细胞运动的负调控。一是直接结合到肌动蛋白和肌球蛋白上，二是激活RhoA信号通路。但它本身的调控机制还不清楚。 miRNA：小的非编码RNA，在转录后调控基因表达参与调控多种的生命活动。他们参与免疫系统的调控可能对淋巴细胞引起的恶性肿瘤的发病有作用。 方法 寻找miRNA靶基因和结合位点 RNA分离和miRNA定量PCR( real-time PCR) DNA构建 荧光素酶报告实验 趋化实验 RhoA pull-down assay 结果 miRNA155抑制HGAL的表达：蛋白水平的检测 (A) 在Raji, MC116, 和VAL细胞系中转染高表达hsa-miR-155 48小时后用Western blot检测HGAL蛋白表达水平， Actin水平作为内参。 从图中可以看出3个细胞系转染了miR-155后，跟对照比相比，HGAL蛋白表达量都有降低。 miRNA155抑制HGAL的表达：mRNA水平的检测 B.Raji细胞系中转染高表达hsa-miR-155通过real-time PCR在转染24, 48, 和 72小时后检测HGAL mRNA水平。 结果 从图中可以看出，在转染hsa-miR-155 72小时后HGAL mRNA的降低水平大到最大 miRNA155抑制HGAL的表达：mRNA水平的检测 C.MC116细胞系中转染高表达hsa-miR-155通过real-time PCR在转染24, 48, 和 72小时后检测HGAL mRNA水平 结果 从图中可以看出，在转染hsa-miR-155 48小时后HGAL mRNA的降低水平大到最大 MiR-155直接作用于HGALmRNA的3＇-UTR上 D、HeLa细胞系中：野生型和3＇－UTR突变HGAL融合双荧光素酶报告基因 。黑柱代表共转染hsa-mir-155与报告基因与3＇－UTR突变Ｍ１或Ｍ２，灰柱表表共转染hsa-mir-155随机突变载体与报告基因。从图中可以看出miR-155可能结合位点Ｍ１突变后荧光素活性没有恢复，Ｍ２突变后荧光素活性恢复８５％。 结果 说明了miR-155转录后调控HGAL的表达是通过与HGAL-3＇UTR上的M2结合位点。 MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 结果 说明了MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性． Ａ．我们探索了miR-155对Raji, VAL和MC116 淋巴瘤细胞SDF-1和 IL-6趋化运动的影响。和对照组相比，转染了hsa-miR-155显著减少了HGAL蛋白表达，加强了SDF-1-诱导的的淋巴瘤细胞趋化运动。 MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 结果 从图上的结果可以看出MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性． Ｂ、Raji细胞接种到 fibronectin coated6-well plates板上，转染hsa-mir-155或 nontargeted对照组48小时后 实时图像一小时内每2分钟拍一次的运动途径。C、在每个处理组中50的细胞平均速度。 miR-155对RhoA活性的影响 结果 A、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时，然后用LPA（1.5 μ克/毫升）处理45秒。转染hsa-mir-155或nontargeting48小时后。细胞裂解用Westernblot检测Total RhoA 的表达，和rhoa pull-down检测RhoA-GTP的水平和检测HGAL的表达。 从图上可以看出在Raji, SUDHL6,和VAL淋巴瘤细胞中转染了hsa-miR-155没有对总RhoA蛋白表达水平产生影响。 说明了RhoA蛋白不是miR-155的直接靶标 miR-155对F-actin的聚合的作用 结果 B、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时，然后处理或不处理45秒LPA（1.5 μ克/毫升）处理45秒。转染hsa-mir-155或nontargeting48小时后。固定后用Alexa-488鬼笔环肽后的染色后用流式细胞仪分析。通过增加RhoA活性，HGAL同样作用于RhoA的下游效应物，下调应力纤维的形成和激动蛋白的聚合 miR-155对F-actin的聚合的作用 结果 图4。bic / miR-155 - / -小鼠脾B细胞趋化性实验。bic / miR-155 - / -或对照组小鼠脾B细胞用于SD