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第六章 吸光光度法 实训一 分光光度计的使用 目的要求二、实训原理T=I/I0 (12-1) A= -lgT = lg(I0/I) = kcb (12-2) 式中: T——透射比； I0 ——入射光强度； I ——透射光强度； A ——吸光度； k——吸收系数； b——溶液厚度； c——溶液浓度。 图6-1 溶液对光的吸收 从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，分光光度计的基本原理是根据上述物理光学现象而设计的。 分光光度计的工作原理是用分光能力较强的棱镜或光栅来分光，棱镜或光栅将入射光色散成谱带，从而获得纯度较高，波长范围较窄的各波段的单色光。这种单色光的波长范围一般约在5nm左右。因而测定的灵敏度高选择性较好，因此若选择最合适的波长进行测定，可以校正偏离朗伯-比耳定律的情况。 吸光光度法的最大优点是可以在一个试样中同时测定两种以上的组分，不必事先进行分离。因为吸光光度法可以任意选择某种波长的单色光，根据不同物质对于不同波长光的吸收不同，可以利用各种组分吸光度的加和性，在指定条件下进行混合物中各组分含量的测定。 三、 光源 单色器 吸收池 检测器 测量系统 图6-2 721型分光光度计主要部件示意图 1.光源: 在可见光区，常用钨丝灯为光源，波长范围约为320～2500nm；在紫外光区，常用氢灯、氘灯为光源，波长范围约为200～375nm。氘灯的辐射强度比氢灯高2～3倍，寿命亦较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，适用的波长范围为180～1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。 2.单色器: 单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的光学装置。白光通过棱镜或光栅将波长按长短顺序分散成单色光。单色器一般由五部分组成：入光狭缝；准光器（一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束）；色散器；投影器（一般是一个透镜或凹面反射镜将分光后的单色光投影至出光狭缝）；出光狭缝。 色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。 棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力大，但吸收紫外光，只能用于350～820nm的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。 光栅是在玻璃表面上每毫米内刻有一定数量等宽等间距的平行条痕的一种色散元件。高质量的分光光度计采用全息光栅代替机械刻制和复制光栅。光栅的主要特点是色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。 光栅分光光度计的单色器光学系统原理见图6-3。 图6-3 单色器光学系统原理图 1一样品池；2一聚光镜；3一平面反射镜；4一入光狭缝； 5一出光狭缝；6一球面反射镜；7一平面光栅 图6-3中，入光狭缝和出光狭缝均位于球面反射镜的焦面位置，通过入光狭缝的光束经平面反射镜反射后射向球面反射镜，球面镜将平行光束反射至平面光栅，经光栅色散后的平行光束又经球面镜反射聚焦在出光狭缝处。 单色器的狭缝设计一定的宽度，经过狭缝的单色光是一个具有一定光谱宽度的谱带，称为光谱带宽。从理论上讲，狭缝的宽度愈小，波长愈接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。 由于分子吸收光谱的吸收峰比较宽和平滑，一般情况下光谱带宽2～6nm对分析结果影响不大。 3.吸收池： 吸收池是盛放样品溶液的容器，它具有两个相互平行、透光且具有精确厚度的平面。玻璃吸收池用于可见光区，石英吸收池用于紫外光区。吸收池的光程长度一般为1cm，也有0.1～ 10cm的。由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明的，在作定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置。 4.检测器： 检测器是一种光电转换设备。它将光强度转变为电信号显示出来。常用的有光电池、光电管或光电倍增管等。光电池由于其光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上。缺点是疲劳效应较严重。 光电管是常用的光电检测器，锑-铯阴极的紫敏光电管适用波长为200～625nm，银-氧化铯-铯阴极的红敏光电管适用波长为625～1000nm。 光电倍增管是目前应用最为广泛的检测器，它利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达108倍，性能好，唯独价格较高。 5.测量系统： 测量系统包括放大器和结果显示装置。早期的分光光度计用表头读数，70年代以来，采用数字读出装置。现代的分光光度计在主机中装备有