基因诊断的常用技术方法.ppt

第一节 基因诊断 一、基因诊断的概念和特点 二、基因诊断的常用技术方法 三、基因诊断的应用 （一）基因诊断的概念: 利用现代分子生物学技术和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 一、基因诊断的概念和特点 （二）基因诊断的特点 针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强 二、基因诊断的常用技术方法 （一）、核酸分子杂交技术 （二）、聚合酶链反应(PCR) （三）、基因测序 （一）核酸分子杂交技术 限制性内切酶酶谱分析法 DNA限制性片段长度多态性分析 等位基因特异寡核苷酸探针杂交法 限制性内切酶酶谱分析法举例 镰形细胞贫血原因：β-珠蛋白链第6位的GAG→GTG，造成Glu→Val所致。 限制性内切酶酶谱分析法举例镰形细胞贫血 限制性内切酶酶谱分析法举例镰形细胞贫血 3、等位基因特异寡核苷酸探针杂交法 设计针对突变和正常的寡核苷酸探针分别进行杂交 在严格条件下进行杂交和洗膜 （二）聚合酶链反应(PCR) 扩增片段长度的变异：有插入或缺失时，扩增长度会增加或变小，与正常长度比较，找出致病基因 PCR-RFLP分析：相差1个碱基，改变酶切位点，因此经酶切后会产生正常基因扩增的扩增产物长度不同的片段 PCR-ASO(SSO)分析：按严格条件进行杂交，找出致病基因。有多种探针可进行反向斑点杂交技术 PCR-序列分析法：对于未知突变或少见的突变，可直接测序确定 引物特异性PCR法：设计2对引物 PCR-SSCP分析法：有突变，长度不变，但构象改变，PAGE的迁移率改变 三、基因诊断的应用 诊断疾病：遗传病疾病、多基因疾病、恶性肿瘤和感染性疾病 HLA的基因分型： 个体遗传基因的鉴定：DNA指纹分析、HLA基因分型、红细胞血型基因检测、各种DNA多态性分析 结构基因及其基因表达的分析 性别鉴定：性连锁遗传病分析、法医学的个人鉴定、运动员的性别检查 生物学分类鉴定 第二节 基因治疗 一、基因治疗的概念 二、基因治疗的基本程序 三、基因治疗的应用与展望 基因治疗的基本方法 基因置换：将致病基因整个地以正常基因置换，使致病基因永久性得到更正。 基因修正：纠正致病基因的突变碱基顺序，而将正常部分予以保留。 基因修饰：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，以目的基因的表达产物来补偿缺陷细胞的功能或使原来的功能得到加强。 基因失活：应用反义技术特异封闭某些基因的表达，以抑制某些有害基因有表达 二、基因治疗的基本程序 （一）治疗性基因的选择 （二）基因载体的选择 （三）靶细胞的选择 （四）基因转移 （五）外源基因表达的筛检 （六）回输体内 获得目的基因的方法 基因的克隆化 基因的人工合成 基因的PCR扩增 人体基因组的降解 载体的选择 物理法 化学法 融合法 受体细胞（靶细胞）的种类 淋巴细胞 造血细胞 上皮细胞 角质细胞 内皮细胞 成纤维细胞 肝脏细胞 肿瘤细胞 将目的基因导入靶细胞 物理学方法 化学方法 融合法 将目的基因导入靶细胞 DNA磷酸钙共沉淀法 显微注射法 基因枪(粒子轰击基因转移技术) 直接注射法 电激转移 染色体介导转移法 受体介导转移法 逆转录病毒介导转移法 腺病毒介导转移法 痘苗病毒介导转移法 同源重组介导的靶向整合(基因打靶) 标记基因技术 将目的基因和标记基因重组在同一或不同表达载体, 导入受体细胞, 适时选用选择性培养基, 筛选标记基因表型, 使导入外源基因的靶细胞存活,而未转导的细胞则不能生存. 如G418筛选 G418筛选原理 新霉素是细菌抗生素, 可干扰原核生物的蛋白质合成, 但对真核细胞则无影响。 G418是新霉素的类似物，对原核和真核细胞均有毒性。 细菌的新霉素磷酸转移酶(neo)基因在真核细胞中表达, 当neo基因与能有效转录的真核DNA序列连锁时就能获得有效有表达。 产生的新霉素磷酸转移酶可使G418失活。 当真核细胞转入neo基因后，就会含G418的选择性培养基中存活，而未转入neo基因的细胞则不能生存。 三、基因治疗的应用与展望 基因治疗的构想阶段（1953～） 基因治疗的实验阶段（1980 ～） 基因治疗的临床应用阶段（1989.1.19 ～; 国内1991.12.31开始血友病的基因治疗) 基因治疗的意义和展望 人类基因治疗的意义 免疫调节: 将抗原的基因或抗体经基因治疗途径导入人体,以改变人体免疫反应应答和调节,对疾病的防治有重要意义. 将细胞因子基因导入人体进行抗病毒和抗肿瘤的基因治疗是目前基因治疗研究非常活跃的领域。 遗传缺陷的纠正：第一次为基因缺陷的遗传病提供了治愈的机会 分泌治疗性的蛋白质，发挥治疗作用 封闭有害基因的表达：以反义技术或反义失活效应抑制、封闭肿瘤基因和病毒基因，治疗病毒性和肿瘤性疾病。 实现基因治疗面临的