5.2用多聚酶链式反应扩增DNA片断试卷.ppt

一、基础知识 （一）、PCR技术的概念 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝 （二）、PCR技术的应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定 2、DNA合成的方向 （1）DNA单链两端的命名 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来 DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合。 ［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？ DNA双螺旋结构提供模板； 碱基互补配对； DNA聚合酶的复查功能。 3、DNA复制的前提——是______________用_________________方法 5、体外DNA复制的条件(PCR 反应的条件) ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶； ⑤ 控制温度，但不需解旋酶. 二、PCR的反应过程 以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率 二、PCR的反应过程 （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （2）PCR循环—复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 二、实验步骤： 三、操作提示： 操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 四、结果分析与评价 1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。 四、结果分析与评价(了解) 2、具体方法如下。 1）．将样品进行50倍稀释：取2μLPCR反应液，加入98 μ L蒸馏水。 2）．以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。 3）．加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。 4）．根据下面的公式计算DNA含量。 DNA含量(μg/ml)=50 x(260nm的读数)x稀释倍数 2．实验操作 1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料(4种dNTP混合物) 、热稳定DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 、两种引物，水 N可以是A、T、C、G。ATP在其中的作用是提供碱基A，不是提供能量的 　　　　　 反应场所： PCR仪（自动调节温度的仪器）。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？ （核基质） 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 练习二(课堂检测) 1、DNA单链的________末端为3,端, ________末端为5,端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子链向下延伸. 2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________. 练习二(课堂检测) 3、一个DNA片段经过30次循环后能形成________个这样的片段. 4依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得 DNA=_____________________________ 引物Ⅰ和引物Ⅱ不同 ① ② 4、循环特点： ①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中最初母链有两条 ③其它子代DNA分子都为双引物分子 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长2N ① ② ①准备好PCR反应体系的配方P62 ②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 ③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁 ④离心10分钟 ⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序 ⑥电泳检测PCR结果 目的： 避免外源性DNA大量扩