第一章蛋白质的化学题库.ppt

（七）蛋白质的含量测定 考马斯亮蓝法，紫外吸收法，凯氏定氮法，其他 八、蛋白质的分离分析技术 1. 根据蛋白质溶解度不同进行分离 盐析法：中性盐盐析，然后透析 等电点沉淀法：溶解度变小而沉淀 低温有机溶剂沉淀法：乙醇或丙酮去除水膜，沉淀 2. 根据蛋白质分子大小不同进行分离 透析与超滤法：利用半透膜，截留不同分子量的蛋白质 凝胶过滤法（分子排阻层析或者分子筛）：凝胶颗粒层析柱 低温有机溶剂沉淀法：乙醇或丙酮去除水膜，沉淀 3. 根据蛋白质带电性质不同进行分离 电泳法：SDS，电荷差异与分子差异 离子交换层析法：阴阳离子交换柱，相同电荷的蛋白质被交换 4. 根据配体特异性进行分离 亲和层析法（aflinity chromatography）：目标蛋白被配体分子结合共价至层析柱中，而非目标蛋白则不能与层析柱结合。 蛋白质的氨基酸序列的确定 多肽链的分离 二硫键的断裂 氨基酸组成分析 N-末端残基的鉴定 C-末端残基的鉴定 多肽链的裂解 肽段氨基酸序列测定 肽段拼接 二硫桥位置确定 干扰素(Interferon,IFN)是动物细胞在受到某些病毒感染后分泌的具有抗病毒功能的宿主特异性糖蛋白。 抗体又称免疫球蛋白（immunoglobulin，简称Ig），是一种由B淋巴细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面 蛋白质的平均含氮量为16%，即每克蛋白质中的氮相当于6.25g蛋白质。 脯氨酸（Pro）是一种亚氨基酸 注意：立体异构体的两种构型与旋光性的左旋与右旋，没有直接的对应关系。 Gly的R基团仅含有一个H原子，介于极性与非极性之间，有时将它归入非极性氨基酸。 利用等电点分离氨基酸。1） 沉淀法 2）根据同一个pH所带电荷不同进行分离 使用甲醛溶液，与氨基酸生成二羟甲基氨基酸，使得氨基pKa值下降2-3个pH，再使用酚酞作指示剂，用NaOH滴定，测定游离氨基的含量 也可以与多肽，蛋白质反应，生成DNP-多肽或者DNP-蛋白质 活性肽的来源 体内途径 （前体经过加工，裂解，酰化，硫脂化等） 体外途径 分离纯化天然活性肽 化学合成 生物合成 酶法水解 五、 蛋白质的结构 蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary），二级结构（secondary），三级结构（tertiary）和四级结构（quaternary）（不总是有）。 （一）蛋白质的一级结构（化学结构） 一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond） HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His- Leu-Val- Glu- Ala- Leu- Tyr –Leu -Val-Cys-Gly Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOH B链 1 5 7 10 15 19 20 21 25 30 HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH 1 5 10 20 15 A链 7 11 6 21 S S S S 牛胰岛素的一级结构 —S————S—— 一级结构确定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。 目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。 （二）蛋白质的空间结构（构象、高级结构） ——蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。 主要方法：是将蛋白质结晶，用X射线衍射法测定原子间距离，得出肽链走向的数据。 由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子多处于同一个平面上。 Cα—C—N—Cα O H —C N— O- H + Cα Cα 氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。 蛋白质构象稳定的原因：1）酰胺平面；2）R的影响。 稳定蛋白质构象作用力：氢键，盐键，疏水键，范德华力 1. 蛋白质的二级结构 —