附件-水中大肠杆菌群及大肠杆菌检测方法－酵素呈色滤膜法.doc

水中大腸桿菌群及大腸桿菌檢測方法－酵素呈色濾膜法 中華民國102年4月8日環署檢字第1020027519號公告 自中華民國102年6月15日生效 NIEA E237.53B 一、方法概要 　　本方法可同時檢測水中大腸桿菌群及大腸桿菌，係以0.45 (m孔徑之濾膜過濾水樣後，將濾膜置於含酵素色質之培養基上，於35 ± 1℃培養22至24小時之後，大腸桿菌除外之大腸桿菌群（Non-E. coli coliform）會形成紅色菌落，而大腸桿菌（E. coli）則會形成深藍色至藍紫色菌落。因此計數濾膜上深藍至藍紫色菌落數即可得到大腸桿菌數目，而計數紅色加上深藍至紫色菌落數目之總和即可得到大腸桿菌群數目。 　　方法原理是培養基內含兩種色原（Chromogen），其中一種（Salmon(-GAL或Red-Gal?）可被半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）水解呈現紅色；另外一種為X-gluc，可被尿苷酸化酶（β-glucuronidase）水解呈現藍色。由於大腸桿菌除外之大腸桿菌群具有半乳糖苷酶，因此菌落會呈現紅色；大腸桿菌（E. coli）則同時具有半乳糖苷酶及尿苷酸化酶，培養時會同時分解兩種色原，而產生深藍色至藍紫色菌落。 二、適用範圍 　　本方法適用於飲用水、飲用水水源、地面水體、地下水體、廢水、污水、放流水及海域地面水體之大腸桿菌群及大腸桿菌檢測。 三、干擾 (一) 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群及大腸桿菌生長之物質。 (二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群及大腸桿菌生長之物質。 (三) 水樣中如含有產氣單胞菌屬（Aeromonas spp.）或假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）細菌時，可能會影響結果。 (四) 懸浮微粒過高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（Spreading）而影響水樣檢測結果之判讀。 四、設備及材料 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1 mL刻度之10 mL無菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管，或無菌微量吸管（Micropipet）。 (三) 稀釋瓶：100至1000 mL能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 (四) 錐形瓶：200至2000 mL能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 (五) 採樣容器：容量120 mL以上無菌之硼矽玻璃或塑膠有蓋容器，或市售無菌袋。 (六) 培養皿：硼矽玻璃製品或市售無菌塑膠培養皿，大小為60 × 15 mm、50 × 12 mm或其他適當大小。 (七) 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙濾杯，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底座。 (八) 抽氣幫浦：壓力差宜為138至207 kPa。 (九) 濾膜：使用直徑47 mm、孔徑0.45 μm且有格線的無菌濾膜。 (十) 吸收襯墊：直徑約47 mm，厚度約0.8 mm之無菌襯墊，須可吸收2.0 ± 0.2 mL之液態培養基，且不可含有亞硫酸根離子等抑制物質。 (十一) 鑷子：前端平滑內側無波紋，使用前浸泡於95%酒精再以火燄燃燒滅菌。 (十二) 水浴槽：溫度能維持在約50℃。 (十三) 培養箱：溫度能維持在35 ± 1℃。 (十四) 加熱板：附磁石攪拌功能。 (十五) 天平：待測物重量大於2 g時，須能精秤至0.01 g；待測物重量不大於2 g時，須能精秤至0.001 g。 (十六) 高壓滅菌釜：溫度能保持在121℃（壓力約15 lb/in2或1.05 kg/cm2）滅菌15分鐘以上。 (十七) 高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在170 ± 10℃達2小時以上。 (十八) 無菌操作檯：正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯（Class II生物安全櫃）。 (十九) pH計：精確度達0.1 pH單位。用於內含瓊脂培養基之pH值測定時，應搭配表面電極（surface probe）。 五、試劑 　　本方法所使用的化學藥品均為試藥級，培養基為微生物級製品。 (一) 試劑水：導電度在25℃時小於2 μmho / cm（μS / cm）。 (二) 培養基：可選用下列三者之一 １、 Chromocult?大腸桿菌群培養基（Chromocult? coliform agar） 每一公升培養基之成分如下： 　? 　　秤取Chromocult?大腸桿菌群培養基粉末13.25 g置於無菌錐形瓶，加入500 mL的試劑水，煮沸溶解後（此培養基不可高溫高壓滅菌），置於45至50℃之水浴槽。待溫度下降至45至50℃後，加入抗生素萬古黴素（Vancomycin）及西蘇羅錠（Cefsulodin）（最終濃度均為5 μg/mL），培養基最終pH為6.8 ± 0.2。培養基混搖均勻，於無菌操作檯內分裝至無菌培養皿中