実験5(生化学分析)-NetLaputa.doc

実験５生化学分析入門レポート 4/18-4/20雨 共同実験者：00818石川聖実　00819市原玲華 実験目的：実験Ａ１酵素免疫分析法 サンドイッチ法のＥＩＡにより代表的な抗原であるヒトIgGを定量する。ここで免疫分析に特有なHigh-dose hook effectを経験し、B/F分離の有効性と欠点について考察する。 実験Ａ２ラテックス凝集法 B/F分離をしないホモジニアス法の代表であるラテックス凝集法を学ぶ。ヒトIgGを定量し、免疫分析の高感度性、高選択性、簡便性を体験する。 実験Ｂ　バイオセンサー 天然物イオノフォアであるであるノナクチンをアンモニウムイオン認識分子として用いる液膜型アンモニウムイオン選択性電極と、ウレアーゼ固定化酵素膜を組み合わせたバイオセンサーを作製し、その構造と原理を理解する。また、電気化学分析の初歩についても学ぶ 実験方法：実験Ａ１酵素免疫分析法；（操作１抗体感作）試験管に抗ヒトIgG原液（10000ppm）をマイクロピペットで36.9μlはかり取り、0.1M炭酸緩衝液を４mlメートルグラスではかりとり、これを加えてよく混ぜた。この溶液を２つのELIZAプレート（角穴１６）に連続分注ピペットで100μlずつ入れ、サランラップをかぶせて３７℃の恒温槽に１時間放置した。 この後、ELISAプレートを裏返して勢いよく逆さにして溶液を捨てた。紙で表面の溶液を吸い取ってからPBS溶液200μlずつを連続分注ピペットで全ての穴に入れ、爪で軽く揺すぶった。これを３回繰り返してからPBS-B溶液を200μlずつ全ての穴に連続分注ピペットで加えてから、ラップをかぶせてから５℃の冷蔵庫に二日間入れた。 （操作２抗原抗体反応）放置後、再びPBS溶液で３度洗い、紙で表面の溶液を吸い取った。次にヒトIgG１mgにPBS-T溶液25mlを加えて調製したヒトIgG溶液（40ppm）を１２本の試験管にPBS-T溶液を用いて、倍数希釈を行い、それぞれ１mlに調製した。この溶液をプレートに希薄な溶液から100μlずつ分注した。また、PBS-T溶液のみを一つの穴に入れた。これにラップをかけ、３７℃の恒温槽に３０分ほど放置した。 （操作３酵素標識抗体の抗原抗体反応）まず、５mlのPBS-TB溶液を試験管に入れ、１μlのHRPを加えて5000倍に希釈した。放置後の２つのプレートのうち１つのプレートに対して、ヒトIgG溶液に抗ヒトIgG-HRP溶液を100μlずつ全ての穴に分注し、ラップをかぶせまた３７℃恒温槽に２０分ほど放置し、PBS-T溶液で２回、PBS溶液で１回、ELISAプレートを洗浄した。もう１つのプレートはPBS溶液でよく洗い、他方と同じようにIgG-HRP溶液を加えて恒温槽に入れた。 （操作４基質の酵素反応と定量操作）o-フェニレンジアミン0.0615gを100mlビーカーにはかり取り、これにクエン酸－リン酸緩衝液を20mlを加え、スターラーで溶解した。これに５％過酸化水素水を100μｌ加えてよく混ぜた直後にプレート全ての穴に連続分注ピペットで100μｌずつ分注した。約３０秒ほど放置すると、淡く黄の着色が認められたので、速やかに２M硫酸を２５μｌずつすべての穴に入れ、反応を停止させた。このプレートをマイクロタイター用比色計を用いて波長490nmで各穴の吸光度を測定した。 実験Ａ２ラテックス凝集法；（操作１ラテックス粒子の洗浄）ラテックス粒子懸濁液をバイブレータで軽く撹拌してから100μｌマイクロピペットでとり、グリシン緩衝液１mlとともに1.5mlマイクロチューブにとり、バイブレータでよく混ぜた後、6000rpmで１０分間遠心分離した。このマイクロチューブのふたを開け、勢いよく上澄み液を捨てた後、グリシン緩衝液500μｌを加え、バイブレーターを用いてラテックス粒子を再浮遊させた。 （操作２抗体感作）抗ヒトIgGを上皿天秤を使用してはかり、試験管に0.009gをとり、グリシン緩衝液2.5mlを加えてよく振り混ぜ、抗ヒトIgGの400ppm溶液を調製した。ラテックス粒子懸濁液にこの抗ヒトIgG溶液500μｌを加えよく混ぜた。３０分後、ＢＳＡ３０％溶液を１７μｌをマイクロピペッターで加えて５℃の冷蔵庫に保存した。二日間おいた後、6000rpmで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨てた。ここで、グリシン緩衝液３mlにＢＳＡ１０μｌを加え、グリシン－アルブミン緩衝液を調製した。遠心分離したマイクロチューブにこの溶液を１ml加えてバイブレーターで再び再浮遊させた。 （操作３抗原抗体反応）ヒトIgG10000ppmの溶液２４μｌをグリシン緩衝液120μｌで希釈し、2000ppm溶液を調製した。この溶液をマイクロピペットで各５０μｌずつ