20160418纤维素和半纤维素酶活性质的(答辩)合编.pptVIP

纤维素和半纤维素酶活性质的研究 答辩人：田传玲 导 师：王瑞君 副教授 研究背景 1 研究内容 3 研究结果 4 2 研究目的及意义 报告内容 结 论 5 致 谢 6 纤维素和半纤维素是植物细胞壁的重要组成部分，据报道每年植物产生的纤维素有1700亿吨，具有广泛的应用前景。 纤维素酶是一类能够催化纤维素降解，使其转化为可溶性糖的一类酶的总称，又称为纤维素酶系、纤维素酶复合物。 自然界中能够利用纤维素的生物种类多，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶，但不同的来源纤维素酶的种类与结构不同，活力方面差别较大。 研究背景 纤维素酶是一类诱导酶，微生物种类、发酵底物、发酵条件不同，其种类与活性不同，酶学特性与稳定性也不相同。 稳定性：酶的稳定性是蛋白质内在的性质，是由其蛋白质表面所带电荷形成的网络和蛋白质中的疏水性残基所决定的。 影响因素：纤维素酶的活性受到底物、温度、pH、离子浓度与种类、表面活性剂、螯合剂、有机溶剂、氧化剂等的影响。 纤维素酶学性质与稳定性 造纸工业。用于造纸和制浆过程，使得纤维素材料能够在短时间内发挥制浆的作用，提高造纸水平。 食品行业。破坏植物细胞壁，使植物原料裂解，利于细胞内有效成分的溶出与利用，提高提取率与原料利用率。 制药工业。改善药物成分的释放，提取中草药有效成分。 酿酒行业。有助于提高发酵效率和酒精产出率。 饲料行业。水解纤维素将其转化为可吸收的糖和菌体蛋白，显著提高饲料利用率和消化率，促进动物生长。 纤维素酶的应用 定性或半定量测定方法。棉线切断法、滤纸崩溃法、羧甲基纤维素钠粘度降低法、纤维素平板法，这些方法存在误差大，操作复杂，适合用于对纤维素酶的筛选评估。 定量测定方法。测定的纤维素酶水解产物的方法大多利用DNS法。其原理是：DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成3,5-二硝基水杨酸，其产物在煮沸条件下显色，颜色深浅与还原糖含量有对应关系，利用这一原理测定还原糖的含量。 纤维素酶活力测定方法 由于微生物种类、发酵底物、发酵条件的不同，微生物所产生的纤维素酶的酶学性质与酶活性相差比较远，而且不同酶学性质的纤维素酶在应用与存方面相差甚远。因此，筛选获得特异性好、效率高的纤维素酶、半纤维素酶具有重要意义。 本研究拟通过从泥土和烂白菜心中筛选分解纤维素的菌株，分别测定不同pH、温度、底物和金属离子对纤维素酶活性的影响，为降解纤维素菌在产纤维素酶方面的研究提高理论依据。 研究目的及意义 粗酶液的提取 将采集到的泥土和烂白菜心放入装有无菌水的摇瓶中，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h，对样品进行富集。取出富集后的培养液1 mL，溶于装有5.0 mL生理盐水的试管中，按照一定的比例进行梯度稀释，然后取200 μL稀释液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基中，37 ℃生化培养箱中培养24 h。随机挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡过夜培养；然后于5000 r/min离心机中离心10 min，弃沉淀，取上清液即为粗酶液，分装后于-20 ℃保存备用。 研究内容 pH对酶活性的影响 使用1 mol/L HCl溶液调节粗酶液pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，振荡培养1 d后，利用DNS法测定溶液OD值，确定酶促反应的最适pH。 金属离子对酶活性的影响 在粗酶液中分别添加Fe2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+的硫酸盐溶液，使其终浓度为0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L和4.0 mmol/L，利用DNS法测定溶液OD值，确定酶促反应的最适金属离子及其浓度。 研究内容 底物对酶活性的影响 分别以滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯和麸皮作为底物，制作牛肉膏蛋白胨液体培养基。取1 mL粗酶液和1 mL不同底物液体培养基于试管中，充分混匀，置于50 ℃水浴锅中进行酶解反应，10 min后加入2 mL DNS溶液沸水浴显色5 min，取出自然冷却后，定容25 mL，分光光度计540 nm处检测OD值。 金属离子对酶活性的影响 取1 mL粗酶液和1 mL相同底物于试管中混匀，分别置于40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃水浴锅中进行酶解反应，10 min后加入2 mL DNS溶液沸水浴显色5 min，取出自然冷却后，定容25 mL，分光光度计540 nm处检测OD值。 研究内容 酶活力测定 取1 mL粗酶液、1 mL 1%木聚糖（pH7.0磷酸钾缓冲液溶液配制）于25 mL具塞试管中，混匀，50 ℃水浴中准确反应10 min；加入2.0 mL DNS溶液，立即沸水浴显色反应5 min，取出后流动水冷却至室温，定容至25 mL，摇匀，在540 nm处测定吸光度（O