一章基因操作的主要技术原理.pptVIP

Agarose gel electrophoresis 对放射性标记的DNA进行放射性自显影 染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。 聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10％） 缓冲液：TBE 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 链分离凝胶-SSCP 用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。 可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等） 核酸测序凝胶 传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。 只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。 4 通过凝胶电泳分离染色体 1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 脉冲场凝胶电泳原理图 北 南 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向，DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样 品增加， 制备DNA样品与常规方法 不同 脉冲场凝胶电泳PFGE工作假说 1)??? DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr） 2)??? DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm） 3)??? 电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp） 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 可以分离几千kb的DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。 PFGE can resolve large DNA fragments 染色体DNA电泳的用途 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 2.?测定基因连锁关系：结合DNA杂交技术，可适合各种生物 3.??染色体DNA重排分析 1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.? 疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物Leishmania, 具有其特征性的染色体。PFG便可用于诊断。 方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。 1.??乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50% DMSO混合 50℃、1 h变性 点样 电泳 染色 观察 5 RNA凝胶电泳 2. 羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：RNA+10mM羟甲基