几种抗肿瘤筛选模型简介案例分析.ppt

抗肿瘤药物的几种初筛模型 2003/6/27 于志斌 前言 近年来,国内外在海洋生物抗肿瘤活性物质筛选和研究上已取得了初步的成果。NCI每年筛选的出3万个新的抗肿瘤化合物这些化合物绝大多数具有独特的化学结构和明显的抗癌、抗病毒作用, 有以影响ＤＮＡ、 ＲＮＡ、蛋白质为主的,也有以干扰有丝分裂或诱导细胞内信息分子的改变为主的。除了一些新的化合物，在一些老的化合物中也发现很多具有抗肿瘤的活性。活性化合物的筛选关键问题之一在于选择有效的活性筛选模型。 本文对ＭＴＴ法、ＤＤＲＴ法、稻瘟霉法以及镰刀菌等几种筛选模型进行简单的介绍。 MTT法 ＭＴＴ法是一种检测细胞生存和增殖状态的方法,该方法以其简单、快速、准确等优点被用于细胞毒和淋巴因子生长抑制的定量检测,尤其在肿瘤化疗药敏实验中广泛使用。其原理是 ＭＴＴ可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为蓝色的甲基化合物,再经适当溶剂溶解后,其吸光度与活细胞数相关,从而可作为检测活细胞数的指标。因此ＭＴＴ法可用于细胞毒活性物质的筛选。 MTT法的基本步骤 细胞培养至90%铺底(处于对数生长期),用胰酶消化液消化收集细胞,吹打制成单细胞悬液,苔芬蓝染色计算活细胞数,接种细胞于96孔板中,每孔加200μl悬浮细胞液,在37℃ CO2培养箱培养过夜。第二天加入各稀释度的菌株发酵液20 μl,继续培养3ｄ,倒去培养液,PBS洗1遍,加入ＭＴＴ(0.2ｍｇ/ｍl)100 μl,在37℃培养4ｈ,然后去除ＭＴＴ,加ＤＭＳＯ与甘氨酸ＮａＯＨ缓冲液(9∶1)200 μl,摇床摇0.5～1ｈ,酶标仪测定570nm吸光值。其中四孔做全培液空白对照,四孔做细胞悬浮液对照,每样平行测试3孔,以阿霉素为标准参照.。计算抑制率： 抑制率=100%×(ＯＤ对照-ＯＤ实验)/ＯＤ对照 发酵液活性以ID50衡量,ID50为抑制率为50%时,发酵液所稀释的倍数；抗癌药物的活性以IC50衡量,IC50为抑制率为50%时,样品的浓度。 DDRT法（different DNA repair test） 试验菌株　343/591为赖氨酸和生物素营养缺陷型并具有发酵乳糖能力和DNA修复缺陷的菌种；343/636为不能发酵乳糖的脯氨酸营养缺陷型菌株并具有紫外线损伤和DNA修复能力。 DDRT法是一种利用两个菌株对DNA损伤修复的差异性建立的方法,可以用来检测试验物的DNA毒性。343/591为DNA修复缺陷菌株,而343/636菌株具有紫外线损伤和DNA修复能力,因而通过两个菌株的修复能力不同可以检测出受试物的DNA毒性。因而DDRT法可用于筛选得到作用于DNA的抗肿瘤活性菌株。 DDRT法的步骤 343/636和343/591菌株分别接种于含5ml蛋白胨-肉汤培养基中； 在37℃振荡培养16ｈ； 用分光光度计测450ｎｍ处的343/591和343/636的ＯＤ值,用蛋白胨-肉汤培养基稀释343/636菌液使其ＯＤ值与343/591相同； 在100ml中性红琼脂培养基中加入1ml菌液后倒入平皿中静置1ｈ； 将所要测定的放线菌发酵液和受试物滴加在覆盖于琼脂培养基上直径为8ｍｍ的滤纸片上；37℃培养24ｈ,以丝裂霉素为标准药物对照,根据发酵液产生的抑菌圈大小的差异来判定其对ＤＮＡ造成损伤的大小及是否有抗肿瘤活性. 稻瘟霉模型 　　近年来,人们发现大量的抗真菌和抗肿瘤化合物有明显的致稻瘟霉菌丝弯曲作用或抑制发芽管生长作用,说明化合物使稻瘟霉分生孢子或菌丝形态生长异常(卷曲、膨胀、菌丝分枝过多或念珠状等)或生长抑制与其抗真菌、抗肿瘤活性之间存在一定的相关性。因此,利用稻瘟霉这一模型筛选抗真菌、抗肿瘤活性菌株有一定的实验依据。 稻瘟霉为一种植物病原真菌,中间有2个横隔为多细胞丝状真菌,其个体比较大,形状特殊,呈亚梨形,易于观察;在沙氏培养液中进行培养只需14～16ｈ,因此非常快速;用96孔平板进行定量,操作程序简单、易于掌握;菌种引进后由自己传代培养,比较经济;此外,用样量少,重现性好,决定其作为初筛模型的优越性。 稻瘟霉活性筛选指标 抑制孢子芽萌发,孢子基本保持原有状态为抑制活性,用“×”表示（a）;孢子不萌发、萌发或菌丝生长,但形态发生严重变化,为强变形活性,用“+++”表示(b);孢子萌发或菌丝生长,但形态发生中等强度的变化,为中等变形活性,用“++”表示(c)。菌丝生长,但生长状态异常,为弱变形活性,用“+”表示(d);菌丝正常生长为阴性,用“-”表示(e)。 稻瘟霉筛选模型的步骤 将稻瘟霉接种在土豆培养基上,在27℃下培养12ｄ左右,收集分生孢子,混悬在10ｍＬ无菌水中,过滤除去菌丝体得孢子悬液,孢