CRISPRCas9基因敲除技术介绍.pdf

CRISPR/Cas9 基因敲除技术介绍 1987 年，日本大阪大学(Osaka University) 的科研人员在对一种细菌编码的碱性磷 酸酶(alkaline phosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小 段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端 还存在一段不太长的特有的序列。不过这在当时并没有引起太多人的注意，报道只不 过是一篇普普通通的小文章。关于这样一个重复序列他们当时在论文中是这样评价的 ——“我们目前也不太清楚这些序列的生物学意义。”不过这个在差不多三十年之前 取得的不起眼的“小发现”现在却绽放出了耀眼的光芒，因为如今科学家正是利用这 个小片段找到了一种可对多种生物的基因组进行遗传改造的工具，而且这种方法操作 起来非常地简单，即现在被称为简便而又实用的基因组改造新技术——CRISPR/Cas 基因敲除技术。 1 技术来源 规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一类独特的DNA 直接重复序列家族，它的结构非常稳定，长 度约25～50bp 的重复序列(repeats)被单一序列(spacers)间隔。CRISPR 是细菌和古细 菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，广泛存在于众多原核 生物基因中，其中II 型为CRISPR/Cas 免疫系统依赖Cas9 内切酶家族靶向和剪切外 源DNA 。自2002 年首次被人们所定义以来，CRISPR 一直以其奇特的结构与特殊的 功能吸引着各国科学家们的共同关注。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA)结合形成双链RNA ，此tracrRNA/ 图1 CRISPR/Cas 系统 1 crRNA 二元复合体指导Cas9 蛋白在crRNA 引导序列靶定位点剪切双链DNA ，其中 Cas9 的HNH 核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC-like 结构域剪切非互补链。具体图 4 所示。 2 CRISPR的基本结构 随着细菌基因组学的发展，CRISPR 的基本结构已逐渐被确定，由短的高度保守 的repeat与长度相似的非重复的spacers序列间隔排列所组成( 图2-A) 。Repeats是一组高 度保守的短小序列，其长度一般为25至50个碱基对。Spacers与repeats 的长度相近，约 为26到72个碱基对。此外一组约由4～10个保守基因组成的序列被发现于CRISPRs周 围，我们称之为CASs(CRISPR-associated sequences，CASs) 。在CAS蛋白中已鉴定出 核酸内切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-结合等结构域，因此，认为CAS蛋 白参与CRISPR 的转录、加工和外来基因序列的降解等过程。 图2 CRISPR 的结构和操作步骤 3 CRISPR的分布和多样性 在已测序的约40%细菌和90%古细菌基因组中至少存在1个CRISPR座位(locus)， 每个CRISPR座位具有几个到几百个R-S重复单位( 图2-A) 。根据CAS蛋白的序列同源 2 性、组成情况和功能，可将CRISPR系统分为8个亚型：Ecoli 、Ypest 、Nmeni 、Dvulg、 Tneap 、Hmari 、Apern和Mtube ，各亚型通常具有2-6个亚型特异的cas基因，在没有 CRISPR系统的基因组中则不存在相关基因。cas1-cas6这6个家族广泛存在于不同的 CRISPR亚型，被认为是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR 亚型，因此，cas1和cas2家族基因也被用作鉴定CRISPR系统的分子标记。此外，间区 序列(S)也具有极其丰富的多样性。 3 技术原理(图5) Cas9 内切酶是一种DNA 内切酶，很多细菌都可以表达这种蛋白，Cas9 内切酶能 够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或者质粒等外源DNA 的侵入。利用Cas9 内切 酶家族来靶标和剪切外源DNA 的II型CRISP