实验二 细菌的革兰染色法、芽孢染色法.ppt

实验二 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法 一、实验目的： 1. 学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。  2. 巩固显微镜油镜的使用技术。 3. 巩固无菌操作技术 二、实验原理： 1.革兰氏染色原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 二、实验原理： 主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。 G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90％）、交联程度高、肽聚糖层厚、脂类含量少→用乙醇不易脱色； G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10％）、交联程度低，肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高→用乙醇易脱色。 2.芽孢染色法原理： 二、实验原理： 芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性和折光性较强。 芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。 二、实验原理： 中央芽孢 末端芽孢 偏端芽孢 游离芽孢 二、实验原理： 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难； 但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢； 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。 三、实验器材 1.菌株： 革兰氏染色：培养12h-16 h枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或者金黄色葡萄球菌（ Staphyloccocus aureus ）和培养24 h大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢染色：培养36 h 的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium ）或者枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 2. 染色液和试剂： 革兰氏染色染色液：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液； 芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 ； 二甲苯、香柏油 。 3. 器材： 载玻片、接种环、试管夹、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 三、实验器材 四、实验步骤 1.革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）干燥：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同。 （4）初染：加适量结晶紫染色液染色1-2min，水洗。 （5）媒染：滴加卢戈氏碘液，媒染1min，水洗。 四、实验步骤 （6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-30 s至流出液无色，立即水洗。 （7）复染：滴加蕃红复染液复染3min，水洗。 （8）干燥：将染好的涂片空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 四、实验步骤 四、实验步骤 四、实验步骤 2.Schaeffer与Fulton氏芽孢染色法 （1）涂片：按常规方法将待检细菌制成薄的涂片。 （2）干燥：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同。 四、实验步骤 （4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），用夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-8min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。 （5）水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 四、实验步骤 （6）复染：用蕃红水溶液染色2min。 （7）水洗： （8）干燥： （9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。 结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。 四、实验步骤 芽孢染色结果 （芽孢呈绿色，营养体呈红色） 四、实验步骤 （10）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。 四、实验步骤 五、实验报告 1、给出（ Staphyloccocus aureus和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 3.绘图说明你所观察的Bacillus megaterium菌体形态，芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。 4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？ 六、注意事项 1、革兰氏染色注意事项 （1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 （2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸