T4噬菌体DNA聚合酶.ppt

三、碱性磷酸酶 　1）碱性磷酸酶种类 　　　 细菌性碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase，BAP），从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。 　　　小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase，CIAP），从小牛肠中纯化出来。加热68 ℃可完全失活。 　2）碱性磷酸酶的特性 　　　 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ HO- -P 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 碱性磷酸酶 5’ P- -OH 3’ 5’ 第四节　DNA修饰酶 第四节　DNA修饰酶 3)碱性磷酸酶的功能 防止线性化的载体份子自我连接 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 第四节　DNA修饰酶 第五节 外切酶核酸（自学） 　　　核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 一、作用于单链的核酸外切酶 　　　如：大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）；大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 二、作用于双链的核酸外切酶 　　　如：大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）；?噬菌体核酸外切酶（ ? exo）；T7噬菌体基因6核酸外切酶 三、既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶 　　　如：Bal 31核酸酶 DNA外切酶 切割方式 识别位点 单链 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I） 5’?3’ 5’-OH 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 5’?3’ 3’?5’ 5’-P 3’-OH 双链 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 3’?5’ 3’-OH ?噬菌体核酸外切酶（ ? exo） 5’?3’ 5’-P T7噬菌体基因6核酸外切酶 5’?3’ 5’-P 5’-OH 单、双链 Bal 31核酸酶 5’?3’ 3’?5’ 3’-OH 不同核酸外切酶的特性比较 第五节 外切酶核酸 第五节 外切酶核酸 第六节 单链内切核酸酶 　 一、S1核酸酶 　　来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae） 　　功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。 　注意： 　对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。 酶量大可完全消化双链， 中量，可在切口或小缺口处切割双链 　　用途： 　　　(1)测定核酸分子的杂交程度； 　　　(2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； 　　　(3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。 一、S1核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 一、S1核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 一、S1核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 一、S1核酸酶 S1的用途：合成CDNA时切除单链环 二、脱氧核糖核酸酶I （DNase I） 　　来源于牛胰脏，分子质量为31ku，是一种糖蛋白。 用途： 　　1.与大肠杆菌DNA聚合酶I一起参加切口平移 　　2.制作DNA文库 　　3.使用DNaseI足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点 　　4.去除转录产物中的模板DNA 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶 一、核糖核酸酶A（RNase A） 　　　来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶。可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3‘端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶3’磷酸及末端带嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。 用途： 　（1）从DNA-RNA或RNA-RNA杂合体中去除未杂合的RNA区 　（2）确定DNA或RNA中单碱基突变的位置 　（3）RNA检测 　（4）降解DNA制备物中的RNA分子 　二、核糖核酸酶H （RNase H） 　　　核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的核内降解，产生不同链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核糖核酸。 第七节 RNA酶 　 用途： 　在cDNA克隆，合成第二链之前去除RNA 。 小　结 酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 习 题 1.???????片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 2.?????? 两单酶切成三个片段,说明各有两个切点 ------p------- p---------