Elisa检测相关器材用料的选择.doc

酶标板材质选择 、聚苯乙烯 最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能。抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。 抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。 二）、聚氯乙烯 聚氯乙烯与聚苯乙烯是类似的塑料，也可作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比 聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。 三）、Uv分析板 聚苯乙烯和聚氯乙烯板在紫外区有很强的吸收不能用于蛋白核酸的定量。Uv分析板可直接读取核酸及蛋白的浓度，在260nm/280nm本底干扰低，但是UV板价格昂贵。 Elisa常用酶系统 一）、辣根过氧化酶（HRP） HRP在蔬菜作物辣根中含量很高。是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD。是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。 HRP的纯度用RZ（Reinheit Zahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。 1、HRP催化反应原理 式中DH2为供氢体，H2O2为受氢体。 HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多化合物可作为HRP的供氢体，ELISA常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和（ABTS）。 2、常用底物 1）、OPD（orthopenylenediamine，邻苯二胺）为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。 2）、TMB（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）没有OPD的缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。 3）、ABTS [2,2’-azinobis (3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。 二）碱性磷酸酶（AP） 大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0 。小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 AP系统的其敏感性一般高于HRP系统，空白值也较低。但是由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，AP价格较HRP高，且制备酶结合物时AP得率较HRP低等。国内在ELISA中一般均采用HRP。 AP催化反应原理 2、反应底物 氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium, NBT），又名为氯化硝基四氮唑蓝。常和BCIP配成混合液，为碱性磷酸酶底物之一，在碱性磷酸酶的催化下生成不溶性的蓝色产物。常用于免疫组化(IHC)、SOD活性测定、免疫细胞化学(ICC)和蛋白印迹(WB)等实验。 制备抗体酶结合物的方法 戊二醛交联法，戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。 过碘酸盐氧化法，只用于HRP的交联。 工作浓度的确定 在ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。 （一）间接法测抗体 1、酶标抗抗体工作浓度的选择 （1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度A，绘制曲线图。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。 2、包被抗原工作浓度选择 （1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。 （2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。 （3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。 （4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。 （5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。 （二）、夹心法测抗原 在夹心法ELISA中可用棋盘滴定法同时选择包