大肠菌群计数课件指导.ppt

大肠菌群计数：第一法 6 操作步骤 6.2 初发酵实验 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。 用直径为3mm的接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱内，培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 大肠菌群计数：第一法 6 操作步骤 6.3 复发酵实验 大肠菌群计数：第一法 大肠菌群计数：第一法 * 各位好，很荣幸今天能有机会代表标准起草协作组在这里和大家共同讨论食品卫生微生物检验的大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的计数问题。 受自己知识的局限，我在介绍的时候可能会有不妥或错误，请大予以提出和指正。 这部分分为3个标准，分别是： * 我们知道大肠菌群的定义是，一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。★ ★ ★ 大肠菌群是卫生学上的概念，不是严格意义上的分类学概念，主要包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等的细菌。该菌群主要来源于人畜粪便, 故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量, 推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 ★ ★ ★ 大肠菌群的检验比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标。 * 标准里给出了3个方法★ ★ ★ ， 其中第1法是对原标准方法的修改，第2法、第3法是这次新增加的方法。下面我想分开来讨论，首先讨论第1法. ★ ★ ★ 也就是MPN法。 * 那么现在这个方法与原4789.3标准相比有那些不同呢。 ★ ★ ★ 首先是操作步骤不同。 原方法 ★ ★ ★ 用的三步法，检样稀释液接种乳糖胆盐发酵管进行初发酵实验，将产酸产气管接种EMB平板进行分离培养，然后挑选可疑菌落进行革兰氏染色和乳糖发酵管复发酵，查表报告结果。 而 ★ ★ ★ 现方法用的是两步法。检样稀释液接种月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤LST进行初发酵实验，将产酸产气管接种煌绿乳糖胆盐肉汤 （BGLB），进行验证实验，查表报告结果。 从这里我们可疑看出 ★ ★ ★ 原方法的操作步骤要复杂一些，特别是在 ★ ★ ★ 分离培养阶段。 按照标准规定，要选取1-2个可疑菌落进行革兰氏染色和乳糖发酵管复发酵这两个方面的鉴定。标准中对所挑选的菌落数量的要求是比较低的，检验者在挑选菌落时都会尽量挑选最典型的菌落，但是根据文献报道，有大约3%的大肠菌群细菌可以EMB平板上形成非典型菌落。另一方面，形成典型菌落的也不一定就是大肠菌群的细菌。所以，原方法对检验者的经验要求也比较高。 而 ★ ★ ★ 现方法操作就简单了一些，受检验者人为因素的影响也相对地小一些。更重要的，这个方法是目前国际通用的方法，比如，ISO，FDA，AOAC，北欧，加拿大等权威标准，都是采用的这个方法。4789标准进行这样的修改，也有采用国际先进标准、与国际标准接轨的考虑。 现标准与原4789.3的再一个不同，就是★ ★ ★ * 初发酵培养基不同。实际上，方法改变以后，培养基都相应地做了改变。这里特别把初发酵培养基拿出来做比较，是因为他们在检验中具有相同的作用。 ★ ★ ★ 原方法用的是乳糖胆盐肉汤；现方法：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ，又叫十二脘基磺酸盐胰蛋白胨肉汤，英文缩写LST肉汤。 LST肉汤 是国际上通用的培养基。与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性，LST中的选择性抑菌剂是月桂基硫酸盐，相对于胆盐稳定性更好些。 还有就是LST更容易观察。 * 这分别是未接种检样时的LST肉汤和乳糖胆盐肉汤。左边 ★ ★ ★ 3 管浅黄色的是LST，右边 ★ ★ ★ 3管紫色的是乳糖胆盐肉汤 * 这是进行同样的接种和培养后的的LST肉汤和乳糖胆盐肉汤。同样也是 ★ ★ ★ 左边LST， ★ ★ ★ 右边是乳糖胆盐肉汤。 ★ ★ ★ 可以观察到细菌生长和倒管中的产气情况。 刚才我们