DNA的粗提取与鉴定探讨.ppt

§5.1 DNA的粗提取与鉴定 学习目标： 1、了解DNA的理化性质，尤其是DNA的溶解性。 2、理解DNA的粗提取以及DNA鉴定的原理。（重点、难点） 3、尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取。（重点、难点） 染色体成分 蛋白质 RNA(少量1%) DNA * 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2.提取DNA的基本思路 提取DNA，去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等 在物理和化学性质方面的差异 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等成分 在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点， 选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解， 而使杂质沉淀； 或者让其他成分溶解， DNA析出 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 1）不同浓度NaCl中DNA溶解度不同。 2）DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同，DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 3）DNA和蛋白质对酶耐受性不同：酶的专一性——蛋白酶水解蛋白质。但是对DNA没有影响。 4）DNA和蛋白质对高温耐受性不同：蛋白质、DNA热稳定性不同。大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 5）DNA和蛋白质对洗涤剂耐受性不同：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 提取DNA的原理包括DNA的 两个方面 溶解性和耐受性 DNA的粗提取实验原理 * 试剂： （二）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 原理、 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 （一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种 原则： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 选用DNA含量相对较高的组织 从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。 哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。 液体培养基中的大肠杆菌的DNA量减少。 鱼卵是减数分裂的产物。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ——容易破碎 ——需要溶解细胞膜 鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液 想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中 经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ (1).溶解DNA：在滤液中加2mol/L的NaCl溶液并搅拌，使染色质中DNA 与蛋白质分离，DNA充分溶解，过滤(除杂质) (2).析出DNA： (4).DNA黏稠物再溶解： (3).滤取DNA黏稠物： (5).过滤： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当0.14mol/L）。 用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。 用两层纱布过滤(4)中溶液。 滤液中含有DNA。 * （三）除去滤液中的杂质 方案一：利用DNA在不同浓度的Na