基因工程重点综述.docxVIP

生物技术制药：是以生物体和生物反应过程为基础，依赖于生物机体或细胞的生长繁殖及其代谢过程，利用工程学原理和方法对实验室所取得的药物研究成果进行开发放大，在反应器内进行生物反应合成过程，进而生产制造出商品化药物。生物技术药物：一般是指采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。生物药物：是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和医学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物包括初级和次级代谢产物，生物体或生物体的一部分。基因工程是将不同DNA片段按照人们的设计与载体定向连接起来，在特定的受体细胞中复制并表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组) 。基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。基因工程诞生的理论基础?理论上–证明生物的遗传物质是DNA（ 20世纪40年代）–明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制（20世纪50年代）–明确了遗传信息的传递方式（ 20世纪60年代）技术上–工具酶(限制性内切酶和DNA连接酶)的发现与应用（基因操作的剪刀，针线）–载体的发现（发现了运载工具）–逆转录酶的发现（便于真核生物基因的获取，因其常有内含子，不便于操作）基因工程制药定义：利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物，以及生物制品的一门技术。工具酶：是指基因工程操作中所使用的核酸酶类根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制这种现象是宿主的限制与修饰,简称（ R/M体系）。限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制，这是维护宿主遗传稳定的保护机制修饰作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素：酶的活性DNA样品的浓度酶切反应的温度、时间DNA的甲基化程度DNA分子的构型反应缓冲液星号活性（是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性）II型限制性核酸内切酶的基本特性：II型限制性内切酶的识别序列一般为4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列II型限制性核酸内切酶的切割方式：①在识别序列的对称轴的5’端切割，产生5’黏性末端②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端同裂酶：是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。同尾酶：是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。T4 DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链的切口DNA连接酶：T4DNA连接酶和大肠杆菌连接酶平末端DNA片段的连接：a. 直接用T4 DNA连接酶连接b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段c. 用衔接物连接平末端DNA分子影响连接反应的因素：1. DNA的浓度（插入片段:载体片段=2:1）2.反应温度（4-16℃）ATP浓度（ATP最适的终浓度为0.5mmol/L）载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA复制子基因工程对载体的要求：（ 1）在宿主细胞内能独立复制（ 2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等（ 3）多克隆位点（ 4）分子量小（ 5）拷贝数多（ 6）具有对受体细胞的可转移性。（ 7）具有较好的安全性，不能任意转移。质粒的一般生物学特性– 1.质粒的分子特性– 2. 质粒的自主复制性– 3.可转移性– 4.质粒的不相容性（又称不亲和性）– 5. 携带特殊的遗传标记理想质粒载体的必备条件：①具有较小的分子量和较高的拷贝数；②具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点)；多克隆位点是指载体上人工合成