烟草培养方法以及转基因方法.doc

烟草转基因 准备工具：EP管灭菌 无菌水 Ms培养基 75%的酒精（蓝口小瓶） 升汞(要回收) 1ml枪 枪头 EP管架 计时器 (1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次； (2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec； (3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次； (4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。光照培养20-30天。 MS培养基 pH (5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2 mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。 (6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，去叶柄，边缘划伤，MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗预培养2-3天(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml中加40ulAs） 不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液； (8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有菌； (9)取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，次放置于摇床摇30min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L + Hygmg/L + Cef 500mg/L pH5.8； 过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。 (11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg2mg/L + Cef500mg/L pH5.8； (12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。 () 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。 农杆菌侵染液的制备 (1) 取-0℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，平板中加入50mg/L Kan和0mg/L Rif； (2) 挑取单斑到含50mg/L Kan和0mg/L Rif的mL LB液体培养基中，放入摇床中℃、200rpm培养过夜； (3) -80℃冰箱保存(4) 摇菌LB液体培养基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）ul、Rif（所需浓度50mg/L）ul及菌液ul，28℃、200rpm过夜 (5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm离心5min； () 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。 () 重复步骤（）一次； () 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到0mL的MS的液体培养基中mg/L的As），即为侵染液。200ml悬菌液 20x大量 10ml 200x有机 1ml 200x铁盐 1ml 200x微量 1ml 蔗糖5.6g 二、烟草转化Hyg筛选压的确定 有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，转基因过程中需用Hyg进行抗性苗的筛选。 以MS培养基为基础，添加不同Hyg浓度梯度进行试验，共设7个Hyg梯度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。取烟草叶片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱培养基中（40-45天），30天后观察受体材料生长情况，统计外植体的出芽率，选择可以抑制受体材料生长的最低Hyg浓度作为筛选压。（70-75天。）最终Hyg筛选浓度为25mg/L