第四章__细胞碎片与包含体产品详解.ppt

第四章 细胞碎片与包含体产品的分离;生物分离过程的一般流程;4.1 细胞碎片的分离;4.1.1 离心沉降;;离心沉降的特点：;4.1.2 微过滤（MF）;4.1.3 双水相萃取;4.1.4 泡沫分离法;4.1.5 吸附分离;4.1.5 吸附分离;（ inclusion bodies IBs);外源蛋白在大肠杆菌中的积累;包含体（Inclusion bodies）—一种不具生物活性的蛋白产物。多为克隆表达产物，这些产物在一级结构上是完全正确的，但在高级结构上是错误的，因而不具生物活性。 包含体形成机理—外源蛋白质在合成过程中缺乏某些协助因子或周围环境不适，使其次级键（氢键等）的形成受影响，最终形成不具活性的包含体产品。;包含体的特性： (1)颗粒直径0.5~1.0μm，可在相差显微镜下观察到。 (2)外围全部被疏水基团包围，不溶于一般水溶液。 (3)质体坚硬，比重较大，适于离心分离，如采用高压匀浆则易造成匀浆阀的破坏。 包含体产品的提取与分离较复杂，回收率一般不超过20%。;4.2.1 包含体产品的一般分离过程;4.2.1 包含体产品的一般分离过程;4.2.1 包含体产品的一般分离过程;4.2.1 包含体产品的一般分离过程;细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包含体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包含体中表达产物为原则。;4.2.3包含体的溶解;4.2.4 目标产物的复性;复性方法;（1）稀释法;（2）透析法;(3)膜过滤法;（4）色谱分离法;（4）色谱分离法; 谢谢大家！