转基因阳性植株的筛选选读.pptxVIP

转基因阳性植株的筛选 组长:刘亚丽 刘慧青 黄西瑞 宁轩 阿米乃 古丽孜热 实验目的 实验目的 学习并掌握植物基因组 DNA 提取的原理与法。 实验原理 实验原理 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。 实验试剂 5 1、CTAB 提取缓冲液（100mM Tris-HCL PH=8.0；20mM EDTA；0.5M NaCl；2%CTAB） （1）1MTris-HCL（pH=8.0）：称取 7.85g Tris，加水充分溶解后，再用浓HCl 调节 pH 至 8.0，最终加水定容至 50mL。 （2）0.5M EDTA（pH=8.0）：称取 3.724g EDTA 溶于 15mL 水中，用 NaOH调节 pH 至 8.0，最后加水定容至 20mL。 （3）5M NaCl：称取 14.65g NaCl 加水充分溶解后，最终定容至 50mL （4）分别量取 3mL 1MTris-HCL（pH=8.0）、1.2mL 0.5M EDTA（pH=8.0）、 3mL 5M NaCl，充分混匀后，加水定容至 30mL。再称取 0.6gCTAB，121℃高压蒸汽灭菌 20min。 6 实验试剂 2、50×TAE 缓冲溶液（40mMTris;20mMHAC；1mMEDTA）：称量 12.1g Tris 和1.86g Na2EDTA·2H2O，加 30mL 蒸馏水充分搅拌混匀。再加入 2.855mL 冰乙酸，充分混匀后，用 NaOH 调 pH 至 8.5，最终加水定容至 50mL。室温保存。使用时稀释 50 倍，即为 1×TAE 电泳缓冲液。 3、氯仿:异戊醇=24:1（体积比）：分别量取 24ml 氯仿、1ml 异戊醇，混匀即可。 4、异丙醇：现成试剂。 5、70%的乙醇：量取 700uL 无水乙醇，加水定容至 1mL。 6、溴化乙锭(剧毒)：现成试剂，在暗室存放。 7、上样缓冲液：现成试剂。 7 四、实验步骤 1、植物组织中 DNA 的分离 （1）取新鲜的植物 0.1g，剪成 1cm 左右的小段，倒入液氮充分研磨。 （2）待充分研磨后，将粉末全部转移至 1.5mL 离心管中。加入 0.5mLCTAB 提 取缓冲液。65℃水浴 10 分钟，期间颠倒 3 次。 （3）加入 0.5mL 氯仿:异戊醇，缓慢颠倒混匀，水浴 5min。 （4）10000r/min 离心 10min。将上层水相移入另一新的 1.5mL 离心管。 （5）加入 0.7 倍体积遇冷异丙醇，冰浴 30min。 （6）10000r/min 离心 10min。弃上清，沉淀用 1mL70%乙醇浮洗。 （7）弃上清，加入 20uL 蒸馏水溶解沉淀，该溶液即为 DNA 溶液。 2、DNA 电泳检测 （1）制备 1%琼脂糖凝胶：称取 0.2g 琼脂糖，加入 20mL 1×TAE 缓冲液，在微 波炉中加热，反复加热，振荡 2-3 次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至 60℃左 右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样 孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 （3）上样电泳：将 5μLDNA 样品溶液和 2.5μL 上样缓冲液混匀后，上样，60V 稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取 出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在 EB 溶液（**EB 溶液为剧毒物，需带上一次性手 套拿取凝胶）中 10min 左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。 第二部分 实验目的 学习并掌握 PCR 的原理与方法。 实验原理 PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 实验试剂 1、dNTP：现成试剂。 2、Taq 酶：现成试剂。 3、引物 p5cs1、引物 p5cs2、引物 qs1、引物 qs2：现成试剂。 4、琼脂糖：现成药品。 5、50×TAE 电泳缓冲液：称量 12.1g Tris 和 1.86g Na2EDTA·2H2O，