树木褐根病诊断鉴定与防治标准作业程序.docVIP

樹木褐根病診斷鑑定與防治標準作業程序 行政院農業委員會 中華民國98年1月第1版 樹木褐根病「診斷鑑定」標準作業程序 1. 目的：建立樹木褐根病診斷鑑定標準化作業程序，供農委會所屬各單位及其他單位相關業務參考。 2. 適用範圍：凡樹木褐根病發生區域均適用。 3. 權責單位：各土地管理單位。 4. 依據：農委會「樹木褐根病防治推動計畫」。 5. 作業說明： 5.1. 診斷鑑定方法包括病徵法、分離培養法及PCR分子診斷法等3種，可依現場實際需求，只要其中一種方法確認，則可確定為發病區或罹病植物。 5.1.1. 病徵法：褐根病菌主要為害根部及莖基部，受害嚴重的林木在地上部會出現全株性衰弱症狀，此症狀為全株黃化、萎凋、小葉化，樹冠葉片變的稀疏，最後枯死（圖1~4）。一般而言，植株愈小，枯死的時間愈短，如有些較小的林木，自地上部枯萎至死亡的時間僅數日至數星期，而呈現快速萎凋症狀，使得剛枯死植株的乾枯葉片與果實大部份仍掛在樹上。植株愈大，枯死的時間愈長，如有些較大的植株自地上部出現枯萎至死亡需數年的時間，而呈現慢速萎凋的症狀，樹冠葉片全株性逐漸黃化萎凋落葉，由茂盛逐漸變成稀疏，最後葉片落光，植株死亡。上述全株性衰弱的症狀並非褐根病的特有病徵，是一般根部病害或根部功能異常共同的病徵。褐根病的特有病徵表現於莖基部與根部：受害林木莖基部及根部表面常有黃色、深褐色至黑褐色菌絲面（圖5~8），但在根部的菌絲面常與泥沙結合而不明顯。受害林木如出現上述病徵就可確定為罹患褐根病。菌絲面在樹皮表面凹陷處較易形成，一般鮮少生長高於立木離地1公尺以上的樹幹。但常因林木死亡時間太長或環境氣候乾燥或有些樹種，黃褐色菌絲面不易觀察。如未觀察到典型菌絲面，可於莖基部及根部的樹皮剥開，受感染的樹皮內面及木材組織呈不規則黃褐色網紋（圖9~10），此黃褐色網紋亦可視為褐根病的特有病徵。如果仍未觀察到典型菌絲面與黃褐色網紋，可將感染的木材組織（病組織）放置在封口塑膠帶內，保持高相對濕度2-5日，病組織表面可形成黃褐色菌絲面。有些罹病樹木的莖基部可觀察到黃褐色到黑褐色的平伏至具菌蓋的子實體（圖11~12），子實體比菌絲面堅硬且有細小菌孔。 5.1.2.分離培養法：對於枯死已久的林木，利用病徵法有時無從判斷是否為褐根病，則可用分離培養法來確定枯死樹木是否為褐根病。採集根部或莖基部腐朽的木材，每棵樹至少取樣兩塊腐木，其長度至少5公分，以確保獲得病原菌。利用褐根病菌選擇性培養基進行分離培養感染腐朽的木材。選擇性培養基的配方及配製為：2 % 麥芽抽出物 (malt-extract)，2% 洋菜。滅菌後，冷卻至50-70℃添加下列藥劑 10mg/l benomyl, 10mg/l dicloran, 100mg/l ampicillin 和500mg/l gallic acid。添加後倒入9cm的培養皿 (約20㏄/皿)。將感染腐朽木材的表面泥土刷乾淨，切成小塊，大小約0.5 × 0.5 × 0.5㎝3，每一感染腐朽木材切取10-20小塊，以每個培養皿放入4小塊，將接好小木塊的培養皿放入24℃生長箱或室溫下1-2星期，如檢體有褐根病菌，小木塊周邊培養基會出現黃褐色（圖13），培養基表面會生長初期乳白色，後漸變成黃褐色的菌落，將菌落的菌絲在顯微鏡下觀察可看到很多桿狀的節生孢子 (arthroconidia)（圖15），較成熟的菌落可形成毛狀菌絲 (trichocysts)(圖16)。本方法僅適合具有微生物專業背景的機關團體。如為個人或一般機關團體，希望利用本方法確認，可將病害樣本送林業試驗所林木健康服務網檢驗。 5.1.3. 感染組織的觀察與採樣：樹木罹患褐根病的樹冠會出現衰弱症狀 (萎凋症狀)，但樹冠並沒有病原菌的存在，要確認樹木是否罹患褐根病，需觀察到罹病樹木莖基部及根部的病徵，以黃褐色的菌絲面及受感染木材組織的黃褐色網紋為主要依據。在病組織的採樣，也需採集黃褐色的菌絲面及周邊組織，和具有黃褐色網紋的木材組織，如能確實採到這些病組織的樣品，檢送檢驗單位較能正確診斷鑑定是否罹患褐根病。 5.1.4. 褐根病PCR分子診斷法： 5.1.4.1罹褐根病樹木根部採樣及核酸之抽取 採集感染褐根病之樹木根部，取0.2g組織於研缽磨碎後，加入2X CTAB核酸抽取緩衝溶液（100 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 20 mM EDTA, 2%CTAB （hexadecryltrimethyl ammonium-bromide）, 0.2% mercaptoethanol, pH 8.0），置於65℃水浴作用1 hr，加熱期間取出震盪數次。之後加入1/2體積之氯仿/異戉醇（chloroform/isoamyl alcohol, CI