质粒的基本知识质粒的基知识.docVIP

质粒　　质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。　　目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。　　在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。 复制原点DNA复制起点，即DNA聚合酶结合位点标记基因一般是运载体上的一段特殊DNA序列，能表达特定形状便???检测运载体是否导入受体（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）启动子转录起始位点，即RNA聚合酶结合位点终止子转录终止位点，也是特殊的DNA序列起始密码子（无启动密码子之说）mRNA上翻译起始的位置，通常为AUG，对应甲硫氨酸，少数细菌（属于原核生物）以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码，线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子终止密码子翻译终止位置，不对应氨基酸，为UAA,UAG,UGA目的基因插入运载体，就是想要使其表达的那一段DNA序列，比如说想将人生长激素基因导入到小鼠体细胞中使其表达，那么人生长激素基因就是目的基因，经限制性内切酶切后与运载体相连（运载体 新教材上为载体） 1. 质粒转化具体操作步骤：? 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；? 将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；? 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；? 42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；? 每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；? 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；? 倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。2. 质粒的抽提具体操作步骤：? 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；? 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶? 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h；? 取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；? 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，? 加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；? 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；? 加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；? 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，? 室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；? 装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）