海洋微生物产抗癌活性多羟基甾醇的优化和半合成研究.docVIP

海洋微生物产抗癌活性多羟基甾醇的优化及半合成研究 陈意光 李厚金* 林永成* (中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275) 摘要：以麦角甾醇为原料，KMnO4为氧化剂，一步法氧化反应得到活性四羟基麦角甾醇 ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22E) 和ergosta-8(14),22-diene -3,5,6,7 -tetrol (3β,5α,6α,7α,22E)，该反应操作和分离纯化工艺简单，产率高，具有进一步的研究与应用前景。研究产活性四羟基甾醇海洋真菌＃2059在特定培养基条件的生长状况及其代谢产物种类和产率的变化。 关键词：多羟基甾醇，ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22E)，ergosta-8(14),22-diene -3,5,6,7 -tetrol (3β,5α,6α,7α,22E)，合成，生理活性 红树林内生真菌№2059，由国际著名真菌学家E B G Jones教授和香港城市大学关利平教授提供，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC №：M202030，保藏日为2002年8月3日，我们从该菌的菌体中分离到一个新的四羟基甾醇：ergosta-8(9), 22-diene-3,5,6,7- tetraol(3β,5α,6β,7α,22E)。该化合物具有较强的抗癌活性，对正常人肝细胞株L-02，人肝癌细胞株Bel-7402和人大细胞肺癌细胞株NCI-4460的IC50分别为13.621，8.445?g/ml和5.03?g/ml，对人体正常细胞的毒性小于癌细胞的毒性，其细胞毒具有一定的选择性，该化合物具有明显的制备抗肿瘤药物的研究前景，该研究成果已申请专利（申请号5）[17~18]。在真菌№2059的菌体中还分离出其它的甾醇，如：麦角甾醇，3β,5α,6β-三羟基麦角甾醇，5α，8α-过氧化麦角甾醇等。有关四羟基甾醇的文献报道，目前还非常少。据有限的文献报道，四羟基甾醇基本上都具有细胞毒活性，但三羟基甾醇很多并不具有细胞毒，四羟基甾醇中羟基的存在和细胞毒性之间的关系以及其作用机理等现在都还不清楚，这些都值得进一步的研究。进一步的研究工作将对内生真菌№2059及其代谢物在制备抗肿瘤药物方面的进一步研究开发打下基础。 本项目将在海洋真菌的菌体中几乎都存在的麦角甾醇用化学半合成方法进行改造，制备得到新的抗癌活性多羟基甾醇，优化反应和分离纯化方法，研究所制备的多羟基甾醇的抗癌和抗菌活性，初步探讨甾体化合物结构与药效之间的关系。 本项目还将运用HPLC、LC-MS、UV等现代分离、检测仪器，研究培养基的组成（碳源、氮源、无机盐、生长素和其它金属离子等）、温度、pH值、培养时间等对活性代谢产物产量的影响，确定最佳的培养条件；确定从菌体中分离，纯化该活性代谢物的最佳途径。 图1 麦角甾醇结构式 图2 在＃2059中发现的四羟甾醇结构式 实验部分 1.1麦角甾醇的氧化： 1.1.1实验仪器及数据 继电器，磁力搅拌反应器， NMR（500MHz）， HPLC 叔丁醇上海凌峰化学试剂有限公司永华特种化学试剂厂，化学纯;麦角甾醇购于Sigma公司;高锰酸钾广州化学试剂厂，分析纯. 1.1.2．反应方程式 1.1.3．实验操作 (1) 将40mg（0.1mmol）麦角甾醇溶于40mL叔丁醇中，外温控制100oC，加热至回流，然后将事先加热至近沸的，pH用NaOH调为11的，含60mg(0.5mmol)KMnO4 100mL加入其中； （2）保持温度，加热回流两个小时； （3）冷却后用EtOAc每次100mL萃取，共萃取三次，合并萃取液，蒸干，得固体42mg； （4）用30mL硅胶拌样。 PE：EtOAc＝3：1为溶剂，定极性，硅胶柱层析分离，以试管每份10mL接收，根据薄层层析检测状况进行合并，再用PE:EtOAc=5:1重结晶。 （5）将最终分离得到纯品: 原料2.1mg, 3β,5α,6α-三羟基麦角甾醇6.3mg, ergosta-8(9), 22-diene-3,5,6,7- tetraol(3β,5α,6α,7α,22E)，ergosta-8(14), 22-diene-3,5,6,7- tetraol(3β,5α,6α,7α,22E)混合物共29.3mg。 1.1.4.实验结果 化合物的波谱数据