hRNA慢病毒载体的构建.PDFVIP

第 ４１卷　第 ６期 贵 州 医 科 大 学 学 报 Ｖｏｌ．４１　Ｎｏ．６ 　　　 　　　 ２０１６年 ６月 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ２０１６．６  人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建 刘　瑶，石　祥，方　文 （贵州医科大学 临床生化教研室，贵州 贵阳　５５０００４） ［摘　要］目的：构建人核内不均一核糖核蛋白 Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１）基因的短发夹 ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）慢病毒载 体。方法：根据 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因序列，设计 ４对 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ的干扰序列和 １对阴性对照序列（ＮＣ ＳｈＲＮＡ）；合成靶序列双链 ＤＮＡ，与 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，通过测序鉴定阳性克隆；用构建的慢病毒 表达载体和包装质粒共转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，荧光显微镜下观察转染病毒 ７２ｈ后细胞中绿色荧光蛋白的表达，以 验证共转染是否成功，超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果：经酶切和 ＢＬＡＳＴ对测序结果比对，重组克 隆中插入的序列与设计合成的 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ完全一致，提示慢病毒载体构建成功；荧 光显微镜下，ＨＥＫ２９３Ｔ细胞可见强绿色荧光蛋白表达，慢病毒载体成功共转染入 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，病毒滴度为 ５ ×１０１１ＴＵ／Ｌ。结论：成功构建人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因 ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，病毒滴度达 ５×１０１１ＴＵ／Ｌ。 ［关键词］ＲＮＡ干扰；慢病毒；２９３Ｔ细胞；载体；短发夹 ＲＮＡ；核内不均一核糖核蛋白基因 ［中图分类号］Ｑ７８２　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１０００２７０７（２０１６）０６０６３００５ ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００２７０７．２０１６．０６．００３ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｆ ｓｈＲＮＡｆｏｒＨｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１Ｇｅｎｅ ＬＩＵＹａｏ，ＳＨＩＸｉａｎｇ，ＦＡＮＧＷｅｎ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｃｉａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆｓｈＲＮＡｆｏｒｈｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ：ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ，４ｐａｉｒｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ