流式演示文稿(2010生)答案.ppt

流式细胞仪 ;流式细胞仪简介 流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是检测细胞各种成分的重要细胞生物学工具。定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分；研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、吞噬性等)；测量细胞或亚细胞结构的新型分析技术和分选技术。 主要包括了样品的液流技术、计数技术和细胞的分选，以及数据的采集和分析技术等。 ;BD FACSCalibur流式细胞分析仪;COULTER MAXM血细胞流式分析仪 美国 ;流式细胞仪的特点： ①测量速度快。最快可在1秒种内计测数万个细胞； ②可进行多参数测量。可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义； ③是一门综合性的高科技技术。它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等多领域的知识和成果； ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 ;流式细胞仪的构造;流式细胞仪主要由五部分组成 1.流动室和液流系统； 2.激光源和光学系统； 3.光电管和检测系统； 4.计算机和分析系统； 5.细胞分选系统 ;1.流动室的基本结构 流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交，得到准确的细胞荧光信息。 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，鞘液包裹着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过检测区域。;;液流驱动系统;进样速率：;2.激光源和光学系统 通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和小功率半导体激光器）。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的侧向光电倍增管接收。;;3.光电管和检测系统： 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。 二种探测器和二类放大器 二种探测器:光电二极管和光电倍增管。 光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC,因FSC是强信号。 光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它们是弱信号。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。;两类放大器:一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。 放大器的作用:可对信号进行微调。通过对FSC,SSC,FL1,FL2,FL3设置放大模式和微调放大增益获得最佳细胞信号。 这是因为从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。;4.计算机和分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器。 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。;5.细胞分选系统 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 ;流式细胞仪有关的测量参数及数据处理 测量参数： 检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。FSC(Forward Scatter),SSC(Side Scatter),第一激光（488nm）激发出的FL1,FL2,FL3,第二激光（635nm）激发出的FL4。 数据处理： 主要包括数据的显示和分析。流式数据可以用一维直方图、二维散点图、等高线图、密度图等来表示。 ;激发光光源波长488nm的示意图;测量参数： 1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理[固有]参数） (1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。（一