western-blot原理及操作流程1116选编.ppt

2016-11-16;Western blot 定义;Western blot 原理; 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 ;Western Blot操作流程;水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。;蛋白样品的定量(Bradford法 );BCA蛋白浓度测定试剂盒; 20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本 ;;;四、Western Blot 转膜;Western Blot 的具体步骤;制作“三明治” “黑胶白膜”;Western Blot 的具体步骤;Western Blot 的具体步骤;五、封闭;六、一抗、二抗孵