沈阳大学研究生实验报告阳大学研究生实验报告.docVIP

研究生课程实验报告学生姓名李娟学号130713000023年级专业2013生态学实验课程名称现代生物学实验技术实验项目名称血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定 实验起止时间2014年3月至实验地点B04-4实验指导教师韩俊艳实验报告成绩实验目的及要求（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化 1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。 2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析、透析等实验原理及操作技术。 （二）血清清蛋白、γ-球蛋白的含量测定与纯度鉴定 1.掌握蛋白含量测定原理和方法。 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳原理、方法和应用。 （三）血清清蛋白、γ-球蛋白的分子量测定 1.学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。 2.掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。 实验方案简要概括实验内容和原理及采用的主要仪器设备等情况 一、血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化 （一）实验内容和原理： 血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。 用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。 脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。提高醋酸???溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的?-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。 经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于鉴定，常需浓缩。浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。 血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。 （二）主要的仪器设备 1.试剂. （1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。 （2）0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵23.12g,加蒸馏水800mL，用稀氨水或稀醋酸调pH至6.5，定容至1000mL。(不得加热) （3）0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释5倍。 （4）0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释3倍。 （上述3种缓冲液要确保浓度和pH的准确性，稀释后要重调pH） （5）300g/L三氯乙酸 （6）纳氏试剂（或BaCL2溶液） （7）葡聚糖凝胶G-25 （8）DEAE纤维素 新鲜血清 （10）聚乙二醇 （11）双缩脲试剂 2.器材 离心机、刻度离心管 、pH试纸、抽滤瓶、黑、白反应板、透析袋、铁架台、层析柱（1.5×20cm）、移液枪、布氏漏斗、培养皿。 二、血清清蛋白、γ-球蛋白的含量测定与纯度鉴定 （一）实验内容和原理 考马斯亮兰法（Bradford法）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残