基因编辑技术选编.pptxVIP

基因编辑技术;全基因组测序技术的不断发展和完善 大型基因组注释项目的实现;2014年3月12日，宾夕法尼亚大学Pablo Tebas教授团队在新英格兰医学杂志撰文称，他们利用Sangamo BioSciences开发的ZFNs基因编辑技术，显著提高了艾滋病患者对艾滋病毒的抵抗能力。;2、“关闭”一个基因，打开生命之门;3、“恢复”受损基因，才能重见光明;二、什么是基因组编辑技术;基因编辑技术的原理;1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。 2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。 3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。;三、基因编辑技术的分类;图B：锌指核酸酶二聚体与?DNA结合示意图。锌指核酸酶的靶序列含有两个锌指蛋白结合位点，不过这两个位点之间还有一段5~7bp的间隔序列，锌指核酸酶里的Fok?I酶切结构域就能够切割这段间隔序列。当然，我们也可以设计出只能够识别左侧或者右侧结合位点的锌指蛋白。; TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33~35个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变双氨基酸残基位点（repeat-variable?di-residues,?RVD）。 与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。 TALEN分子比ZFN大得多，因此很难高效导入，科学家们也想出了不少的办法，如金门分子克隆技术（‘Golden?Gate’molecular?cloning） 。 ;CRISPR/Cas系统;其基因座结构可分为三部分：5‘ 端为tracrRNA 基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3’ 端为CRISPR 基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成。;CRISPR/Cas的作用机理（分为三个阶段来理解）：;噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer 的5‘ 或是3’ 端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2～5碱基，一般与protospacer 相隔1～4 碱基．新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM，将临近PAM 的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR 基因座的5‘端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间(图2)。目前只有第一个步骤被证实。;第二，CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）：多个研究表明CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成， TypeⅡ型CRISPR/Cas系统crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNaseⅢ参与以外，还需要tracrRNA的指导 ； ;第三，是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为crRNA的间隔序列(spacer)与外源DNA 的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，但是后来的研究证明spacer 与protospacer 部分互补配对时切割也可以发生。;;CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较;靶标： ZFNs理论上可以靶定任何序列，但实际上，目标的选择受限于模块的可行性（基于序列依赖的组装平台合成）。利用公共数据库，基因组DNA序列上平均每100bp就可制备1个功能性ZFNs。 TALENs靶标受限于需要第一个碱基是胸腺嘧啶，另外，不是所有的TALENs都能在体外有效工作，而且一些还不能产生预期的突变，这就意味着每个TALEN对都需要进行实验验证。比