熒光原位杂交实验 Fluorescence In Situ Hybridization.pptVIP

荧光原位杂交实验 Fluorescence In Situ Hybridization ;原位杂交(In situ hybridization)1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) ——70年代 2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) ——80年代中后期 （1）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)**同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐。 5）同位素的使用和处理;实验的基本原理: FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. ;DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.;;;;**荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。**FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记） ;FLUORESCENT labeled dUTP ;染色体复染的物质:  Propidium Iodide (PI)（红色） DAPI（兰色） quinacrine（绿色） chromomycine A3（绿色）;;　　染色体“原位抑制”杂交（chromosome in situ suppression, 　　　CISS)克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitor DNA)，如human Cot-1 DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。**FISH技术的应用1）基因（或DNA片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与　　诊断）；4）肿瘤遗传学研究;**用于FISH的探针1）单拷贝探针： （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。;DNA片段的染色体定位;FISH检测微小缺失;染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1;21q22.2 BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号;２）简单重复序列探针(simple repetitive probes)——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes) 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别