基因工程实验指导.pdf

实验一 大肠杆菌感受态的制备及转化? 1.? 实验目的 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒? DNA? 转入受体细胞的 技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。? 2.? 实验原理 转化（transformation）：是将异源 ?DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。进 入细胞的?DNA?分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传 性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变株。 自然界中多数细菌的转化频率较低，如大 肠杆菌等。但 受体细胞经过一些特殊方法（如： 电击法，CaCl2，RuCl?等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许 有外源?DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent?cells)? 。在一定条件下，将带有外源? DNA 的载体分子与感受态细胞混合，可以使载体?DNA 分子进入受体细胞。常用的转化方 法主要有以下两种：? 1） 化学法(热击法)；使用化学试剂（如? CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将 载体?DNA 分子导入受体细胞；? 2） 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体?DNA 分子导入受体细胞。 进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。将经过转化的细胞在选择培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带 有异源?DNA 分子的受体细胞。 本实验以?E.? coli? DH5α?菌株为受体细胞，用?CaCl2?处理受体菌使其处于感受态，然后 与?pUC19?质粒共保温，实现转化。pUC19?质粒携带抗氨苄青霉素和?lacZ’基因，因而接受 了?pUC19?质粒的受体菌具有了抗氨苄青霉素的能力，能在含有?amp?的培养基上存活，从 而将转化细胞筛选出来。? 3.? 仪器、材料和??剂 仪器： 超净工作台，恒温水浴，分光光度计，冷冻离心机，摇床，移液枪， 水 浴 锅 试剂：? LB?培养基（液体、固体）：胰蛋白 胨? 10g， 酵母提取物? 5g，? NaCl? ? 10g， 调?pH7.0。高压灭菌)? 1M?CaCl2(预冷，过滤除菌)? 1M?MgCl2(预冷)? 含?amp 的固体?LB?培养基（琼脂浓度? 15g/L） 冰块若干 材料：大肠杆菌菌株：E.coli?DH5α 质粒：pUC19 1? 耗材： 带盖离心管(预冷)，枪头(预冷)，PE?手套? 4.? 操作步骤? 4.1? 感受态的制备? 1） 从新活化的 E.coli?DH5α 菌平板上挑取一单菌落，接种 于 3～5ml?LB 液体培养中，? 37℃振荡培养?12h 左右，至对数生长期。将该菌悬液以?1:100～1:50?转接于?100ml?LB?液体 培养基中，37℃振荡培养，当培养液开始出现混浊后，每隔?20～30min?测一次?OD600，至? OD600≤0.5?时停止培养。? 2） 在无菌条件下将细菌转移到一个冰预冷的无菌 50mL 离心管中，冰 上放置 10min， 使培养液冷却至?0°C。（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快）? 3）? 4°C?2500×g 离心?5min，倒尽培养液，回收细胞。? 4） 用?20mL（原体积的?1/5）无菌冰预冷的?0.1mmol/L?MgCl2?悬浮细胞，4°C?2500×g? 离心?5min，倒尽培养液，回收细胞。?